离体神经元损伤后Homer1a与Notch信号的作用及关系研究

来源 :第四军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Viola2007
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Notch基因于1917年在果蝇体内被发现,因为其部分功能缺失后可致果蝇翅膀边缘出现切迹而得名。Notch信号通路是一条细胞间的保守的信号传导途径,在中枢和外周组织许多器官早期的发育过程中起着非常重要的作用。该信号途径的精确调控对于大多数组织的正常发育至关重要。既往文献显示,脑组织冷冻损伤后Notch信号通路的表达出现短暂性升高。有学者推测,Notch信号通路可能在脑损伤后发挥重要作用。Homer蛋白家族于1997年被首次发现。Homer蛋白参与mGluR1a从胞浆内质网到突触后膜的转运及在突触后膜的定位,并可影响细胞Ca2+通道、Shank、细胞骨架蛋白等的作用,是细胞信号传导系统的关键点。既往文献显示Homer蛋白在细胞水肿、坏死、凋亡、再生的各种信号途径中发挥重要作用。本实验通过体外原代培养的神经元细胞及其机械性损伤模型上采用免疫组化和蛋白印迹的方法,研究了Notch信号通路和Homer-1a蛋白在培养神经元细胞中的表达与互相作用的规律,并初步探讨其意义,为下一步探寻创伤性脑损伤中可能的分子机制打下基础。实验一体外培养小鼠脑皮层神经元机械性损伤模型的建立目的建立并验证原代培养皮层神经元机械性损伤模型,为下一步进行神经元损伤的分子病理学实验奠定基础。方法胎鼠大脑皮层神经元体外原代培养,光镜下观察其生长情况,培养7天待神经元成熟后,用移液器枪头划伤神经元造成机械性损伤。观测细胞的形态改变,并检测培养液乳酸脱氢酶活性来评价神经元损伤情况,验证模型是否可行。结果神经元体外培养7天后,光镜下可见神经元细胞核清晰,呈圆形,核仁较清晰。胞体呈多形性,胞质透亮,有较多轴、树突自胞体伸出,且在神经元之间交织成网。机械性划伤后伤后即见划伤区域神经元结构完全消失,呈空白区,可见较多细胞碎屑,损伤区周围细胞突起受损,培养液乳酸脱氢酶活性升高。结论利用胎鼠大脑皮层体外原代培养生成的神经元所制的神经元划伤模型是一种简易有效的体外培养神经元机械性损伤模型。实验二NICD和Homer-1a在神经元机械性损伤模型中分布和表达趋势目的观察NICD与Homer-1a在正常体外培养神经元上的分布与损伤后的表达趋势。方法利用免疫组织化学法检验成熟神经元上NICD与Homer-1a的分布,通过Western Blot方法检测神经元机械性损伤后NICD和Homer-1a的表达趋势。结果体外培养成熟神经元的胞体和突起上具有NICD和Homer-1a的共表达,机械性损伤后,NICD和Homer-1a在不同时间点(1h,3h,6h,12h,24h)的表达分别呈现一定趋势。结论NICD和Homer-1a共表达于成熟神经元,并可能在神经元机械性损伤中发挥着一定作用。实验三改变Notch信号对神经元机械损伤的作用和对Homer-1a的影响目的观察改变Notch信号对神经元机械损伤后的作用和对Homer-1a的影响。方法DAPT和VPA分别预处理神经元24h,神经元机械性损伤后,通过Western Blot方法检测Caspase-3和Homer-1a的变化。结果机械性损伤后,与损伤体组比较,DAPT处理组Caspase-3明显降低(P<0.05),Homer-1a表达降低(P<0.05);VPA处理组Caspase-3明显升高(P<0.05),Homer-1a表达升高(P<0.05)。结论抑制Notch信号能减少机械性损伤后神经元的凋亡,而上调Notch信号能增加机械性损伤后神经元的凋亡,此作用可能与Notch信号对Homer-1a的调控有关。实验四过表达Homer-1a对神经元机械损伤的作用和对Notch信号的影响目的观察过表达Homer-1a对神经元机械损伤后的作用和对Notch信号的影响。方法病毒载体预处理神经元48h,过表达Homer-1a,神经元机械性损伤后,通过Western Blot方法检测Caspase-3和NICD的变化。结果机械性损伤后24h,过表达Homer-1a组与对照组和空载体组比较,过表达Homer-1a组Caspase-3明显升高(P<0.05),对Notch信号并无明显影响(P>0.05)。结论过表达Homer-1a增加了机械性损伤后神经元的凋亡,Homer-1a可能处于Notch信号的下游。
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