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肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是产志贺毒素大肠杆菌(Shiga-toxin producing Escherichia coli, STEC)的一类亚群,1982年被证实是一种重要的人畜共患病原菌,可以引起人不同程度腹泻、出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis, HC),溶血性尿毒综合症(Haemolytic uraemic syndrome, HUS)等,严重的可导致死亡。其代表血清型为0157：H7,其它非0157EHEC血清型主要包括026、0111、O103、O121、045、O145、O104、O91等。本研究通过PCR方法结合头孢克肟-亚碲酸钾山梨醇麦康凯琼脂(Cefixime-potassium tellurite Sorbitol MacConkey, CT-SMAC)平板分离法对采集的样本进行EHEC的分离与鉴定,并对分离菌株进行相关生物学特性研究,分析分离菌株之间的进化关系,以及与国际上流行的EHEC之间的亲缘关系。具体研究内容如下：1.肠出血性大肠杆菌的分离与鉴定运用PCR方法检测样本中EHEC的两个主要毒力基因stx1/stx2,结合CT-SMAC平板分离法对2011-2013年华中地区1477份样本(猪肠道内容物432份,猪粪便480份,牛粪便397份,牛奶99份,奶牛场环境中的水样69份)进行EHEC的分离,并通过革兰氏染色、生化鉴定、血清型鉴定、16SrRNA基因鉴定等方法对分离菌株进行鉴定。共分离到EHEC93株,占分离样本总数的6.30%(93/1477),其中猪源EHEC53株,占猪源分离样本总数的5.80%(53/912),牛源EHEC40株,占牛源分离样本总数的7.1%(40/565)。93株EHEC涵盖了28种血清型,以0157、O26、O91、O100、097、092为主要血清型。2.肠出血性大肠杆菌生物学特性研究对93株EHEC的溶血特性、致Vero细胞毒性、药物敏感性分析研究表明,8株猪源EHEC,5株牛源EHEC对5%脱纤维绵羊血红细胞有溶血现象。91株携带有stx1和/或stx2基因的EHEC都能使Vero细胞产生病变,其余2株EHEC没有携带stx1/stx2基因不能使Vero细胞产生病变。40株牛源EHEC对诺氟沙星的敏感率最高,达到97.5%。对阿莫西林、氨苄西林、先锋霉素Ⅳ、先锋霉素Ⅵ、卡那霉素、头孢噻肟的敏感率都在20%以内,基本不敏感。53株猪源EHEC对氧氟沙星的敏感率最高,达到88.7%,对阿莫西林、氨苄西林、磺胺异恶唑、链霉素、庆大霉素、四环素、新霉素、复方新诺明、卡那霉素、红霉素这10种药物完全耐药。EHEC分离株对小鼠致病性研究表明,6株受试代表菌株和标准菌株EDL933(O157:H7)感染后,死亡率有一定差异,出现临床症状的小鼠各组织器官主要病变为小肠(尤其是十二指)积液,局部肠粘膜水肿、充血、出血；盲肠、结肠水肿；心脏、脾脏无明显病理变化,肝脏、肾脏均有肿大出血；肺膨大。小鼠各组织器官活菌浓度可达到108CFU/g左右,以盲肠、结肠活菌浓度最高,其它脏器带菌量相对较少。3.肠出血性大肠杆菌多位点序列分型及遗传进化分析根据大肠杆菌mlst.ucc.ie数据库提供的多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)方案,对93株分离菌株7个管家基因进行PCR扩增,将PCR扩增产物送上海生工进行双向测序,将测序结果在大肠杆菌mlst.ucc.ie数据库中比对,从而确定每株菌的序列型。利用MEGA5.0软件分别对分离菌株进行分子分型及遗传进化分析,93株EHEC共有13个序列型(Sequence type, ST),其中ST297为优势序列型,比例为31.1%(29/93)。遗传进化分析表明,ST297型与国际上流行的EHEC具有较近的亲缘关系。