PAR-2在小鼠真菌性角膜炎中对炎症调控的实验研究

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目的:研究蛋白酶激活受体-2(protease-activated receptor-2,PAR-2)在烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)感染角膜炎中的表达、功能及其作用机制。方法:1、烟曲霉菌感染C57BL/6小鼠角膜,建立小鼠真菌性角膜炎动物模型,采用PCR法和Western blot法检测小鼠正常角膜和感染后12小时、1天、2天角膜中PAR-2m RNA的表达以及正常角膜和感染后1天、2天、3天角膜中PAR-2蛋白的表达。2、给予小鼠角膜0.25、0.5、1.25mmol/L PAR-2拮抗剂(FSLLRY-NH2)预处理,建立小鼠真菌性角膜炎动物模型,采用PCR法和Western blot法检测小鼠正常角膜、感染对照组角膜和FSLLRY-NH2预处理后角膜中PAR-2 m RNA和蛋白的表达。3、给予小鼠角膜FSLLRY-NH2预处理,建立小鼠真菌性角膜炎动物模型,观察小鼠角膜感染后临床评分,采用免疫荧光法及MPO法检测正常角膜、FSLLRY-NH2预处理前后感染角膜中中性粒细胞的数量变化;采用PCR法和Western blot法检测各组小鼠角膜中PAR-2、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、MIP-2 mRNA和蛋白的表达。4、采用酪蛋白刺激法从小鼠腹腔中提取中性粒细胞,烟曲霉菌刺激细胞,采用Western blot法检测正常中性粒细胞,烟曲霉菌刺激后12小时、18小时、24小时中性粒细胞PAR-2蛋白的表达。5、给予小鼠腹腔中性粒细胞FSLLRY-NH2预处理,烟曲霉菌刺激细胞,采用Western blot法和ELISA法检测正常中性粒细胞、FSLLRY-NH2预处理前后感染中性粒细胞中PAR-2、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、MIP-2和p-ERK1/2蛋白的表达。结果:1、小鼠角膜烟曲霉菌感染后12小时、1天、2天角膜中PAR-2 mRNA的表达显著高于正常角膜,其中感染后1天PAR-2 mRNA的表达最高;感染后1天、2天、3天角膜中PAR-2蛋白的表达均明显高于正常角膜,其中感染后2天PAR-2蛋白的表达最高。2、给予小鼠角膜0.5、1.25 mmol/L FSLLRY-NH2预处理后,角膜中PAR-2 mRNA的表达较感染对照组相比显著下降,差异有统计学意义;0.25 mmol/L FSLLRY-NH2预处理后,PAR-2 mRNA的表达下降,但差异无统计学意义;1.25 mmol/L FSLLRY-NH2预处理角膜后,PAR-2蛋白的表达较感染对照组显著降低。3、与感染对照组相比,FSLLRY-NH2预处理小鼠角膜后,小鼠角膜炎症反应明显减轻,临床评分显著降低;角膜组织内中性粒细胞数量明显减少;炎症细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ、MIP-2 mRNA和蛋白的表达显著降低。4、烟曲霉菌刺激小鼠中性粒细胞后12小时、18小时、24小时,PAR-2蛋白的表达明显高于正常中性粒细胞,其中刺激后18小时表达最高。5、FSLLRY-NH2预处理中性粒细胞,可以显著降低中性粒细胞中PAR-2、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、MIP-2和p-ERK1/2蛋白的表达。结论:C57BL/6小鼠角膜感染烟曲霉菌可以引起PAR-2的表达升高,提示PAR-2参与真菌性角膜炎的炎症反应进程。下调PAR-2可以减轻角膜炎症反应程度,减少角膜组织中性粒细胞浸润,降低炎症细胞因子表达。PAR-2通过ERK1/2途径,调节下游炎症细胞因子表达。
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