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研究背景各种急慢性呼吸系统疾病常存在病原体感染、内毒素产生、炎性介质和炎性因子释放、缺氧、缺血、酸中毒等诸多因素中的一种或多种,这些因素可导致血管内皮受损和组织因子释放,激活各种凝血因子,使血液呈高凝状态或(和)血栓形成。凝血酶是参与此过程中的重要凝血因子之一。已有研究资料证实,除发挥凝血功能外,凝血酶还具有重要的非凝血功能,即通过与细胞膜表面的蛋白酶激活受体-1(PAR1)结合,激活一系列下游信号通路,在细胞的生长、增殖、分泌,粘附等方面发挥重要作用。在急性肺损伤和各种慢性肺部疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)、肺间质性疾病中,肺泡灌洗液中的凝血酶浓度显著升高,其与PAR1结合,产生各种病理生理作用,如促进各类炎症因子IL-6、IL-8、PGE2、GM-CSF的释放,调控肺部的炎症反应及修复增殖。另有研究表明凝血酶可通过激活NADPH氧化酶亚单位p47(phox)和p67 (phox)诱导多种细胞如血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、海马神经元细胞等产生以活性氧(ROS)为主的自由基。ROS对细胞的作用具有两面性,一方面,高浓度下具有损伤作用,参与促进细胞的凋亡、坏死过程；另一方面,低浓度可作为重要的信号分子,参与细胞信号转导,主要激活MAPK通路,通过激活转录因子,影响基因的表达,促进细胞增殖、分化等。核因子NF-κB是重要的转录因子之一,在氧化应激、感染、炎症反应、细胞凋亡及异常增殖等病理过程中,因调节多种靶基因的表达而发挥重要作用。肺成纤维细胞是肺组织重要结构细胞,占肺间质全部常驻细胞的95%以上,也是参与肺损伤修复的主要细胞。在损伤后的修复过程中,成纤维细胞表现出极高增殖反应。各种损害因子导致肺部毛细血管通透性增加,血浆成分渗漏到毛细血管外并与肺成纤维细胞接触,刺激该细胞的增殖修复反应。推测凝血酶可能在其中发挥一定作用。研究目的凝血酶作用于肺成纤维细胞,检测细胞产生ROS情况及产生途径,观察ROS是否可以活化MAPK信号系统,进而影响核转录因子NF-κB,调控生长基因的表达。研究方法选择人肺成纤维细胞(HLF)作为体外研究对象,一定浓度的凝血酶作用于该细胞。MTT法和流式细胞Brdu掺入法检测凝血酶促人肺成纤维细胞增殖现象；利用化学荧光法、流式细胞检测技术和GSH检测试剂盒检测活性氧的产生；Western blot法检测PAR1, NADPH氧化酶、ERK1/2及p38MAPK信号蛋白的表达；激光共聚焦显微扫描技术观察NF-κB中亚单位p65向核内转移情况。研究结果1.在0.1U/ml-20U/ml浓度范围内,凝血酶对细胞的增殖能力随浓度递增而增强。在10 U/ml及以上时,与对照组比较,可显著促进HLF细胞的增殖(P<0.05),但当浓度超过20U/ml,增殖作用不再增强；20 U/ml的凝血酶分别作用HLF 24 h、36 h、48 h、60h、72h,从36h时间点开始,与对照组比较,凝血酶组细胞增殖能力显著增强(P<0.05)；BrdU掺入增殖实验结果显示,凝血酶浓度在10 U/ml及以上时,较对照组可显著促进HLF细胞增殖(P<0.05),并随浓度增加而增强,但当凝血酶浓度超过20U/ml,增殖作用不再更强。2.5U/ml及以上浓度的凝血酶可显著增加HLF内的活性氧数量(P<0.05),并呈剂量依赖关系,但当浓度大于20U/ml,活性氧的量不再增加；20U/ml凝血酶作用HLF细胞30min,流式检测显示细胞内ROS产生量较对照组增加64.7%,作用1h时细胞内ROS量较对照组增加138.8%,而加入凝血酶拮抗剂水蛭素组细胞内ROS量与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)；10U/ml和20 U/ml的凝血酶作用HLF细胞,细胞内GSH/GSSG比值较对照组显著降低(P<0.05),而加入水蛭素或氧自由基拮抗剂NAC组,GSH/GSSG之比与对照组无统计学差异(P>0.05)。3.20 U/ml凝血酶作用于HLF细胞10min和30min,胞浆内NADPH氧化酶亚单位p47phox和Rac2表达显著降低(P<0.05),1h后几乎无蛋白表达。加入水蛭素组与对照组比较,p47phox和Rac2表达无统计学意义(P>0.05)。4.凝血酶作用于HLF细胞10min到2h,细胞内磷酸化ERK1/2表达水平较对照组显著升高(P<0.05),而提前加入NAC或水蛭素组则无表达；细胞内p38MAPK磷酸化不受凝血酶影响,即凝血酶作用HLF细胞10min到2h,蛋白磷酸化水平较对照组无统计学差异(P>0.05)。5.凝血酶分别作用HLF细胞5min、10min、30min、1h和2h,各时间点细胞核内代表p65的荧光含量与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),而佛波酯组荧光含量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。6.支气管上皮细胞和肺成纤维细胞均有PAR1蛋白表达,肺成纤维细胞受体表达更明显(P<0.05)。结论1.凝血酶具有促进人肺成纤维细胞HLF增殖的能力。2.凝血酶促进HLF细胞增殖机制包括如下。2.1凝血酶受体PAR1在HLF中有较高表达。2.2凝血酶通过与PAR1受体结合,激活NADPH氧化酶,诱导细胞产生活性氧。2.3凝血酶通过磷酸化ERK1/2而不是p38MAPK,激活生长信号转导通路。2.4凝血酶促进HLF增殖过程中,无核因子NF-κB参与。意义凝血酶通过与肺成纤维细胞上的受体PAR1结合,激活NADPH氧化酶,诱导细胞产生活性氧,活性氧激活MAPK信号通路中的ERK1/2信号途径,实现促人肺成纤维细胞增殖过程。该研究初步探讨了凝血酶对人肺成纤维细胞的促增殖作用机理,为寻找凝血功能紊乱相关肺部疾病的新的防治靶点提供依据。