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花椒,系芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum L.)植物花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)的干燥成熟果实。前期,静息态功能性磁共振技术(fMRI,Functional magnetic resonance imaging)研究表明花椒能显著激活海马、海马旁回等与学习记忆相关的脑区,提示我们花椒可能具有改善学习和记忆障碍的活性。然而,其有效的活性部位和相关的作用机制仍不明确。目的:首先应用静息态功能性磁共振成像技术探讨花椒的中枢响应机制;其次通过建立小鼠学习和记忆障碍的病理模型,系统研究并筛选花椒改善认知障碍的有效活性部位及其相关的分子作用机制;然后进一步考察主要成分羟基-α-山椒素(HAS)的稳定性。方法:(1)花椒的中枢响应机制研究:应用静息状态的功能性磁共振成像(restfMRI)技术,以低频振幅(ALFF)、部分低频振幅(fALFF)以及功能连接度(FC)等分析手段为主,得到舌下含花椒粉末(0.1 g)刺激前后的信号增加或减弱的脑区位置,探讨静息状态下花椒的中枢响应机制。(2)花椒改善学习和记忆障碍的有效部位筛选:通过东莨菪碱建立学习和记忆障碍的小鼠病理模型,用Morris水迷宫(训练期间的逃避潜伏期、探索期间的目标象限停留时间和平台穿梭次数)、避暗试验(逃避潜伏期)及海马病理学组织切片等检测手段来筛选花椒改善学习记忆障碍的有效活性部位。(3)HAS(1.25、2.5、5.0 mg/kg,i.g.)对小鼠学习和记忆障碍改善的药理活性及作用机制研究:建立东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍病理模型,通过小鼠水迷宫、避暗试验及海马病理学组织切片评价HAS的改善学习记忆障碍的药理活性;通过海马组织乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)水平、环磷腺苷效应原件结合蛋白(CREB)和脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA表达水平和蛋白表达水平检测,探讨其改善学习记忆障碍的作用机制。(4)花椒水提物中HAS的稳定性研究:重点考察温度、空气氧、紫外光、pH值、人工胃肠液等因素对花椒水提液中HAS化合物稳定性的影响,该研究有利于提高HAS保存率,保证临床疗效。结果:(1)静息态功能性磁共振成像结果表明,花椒刺激时大脑双边的海马(HIPP)、海马旁回(paraHIPP)、前额叶(PFC)等脑区的ALFF和fALFF信号明显增高,以右侧较显著;双侧海马与对侧海马以及海马旁回的功能连接度增强,提示花椒可能具有改善学习记忆障碍的作用。(2)花椒的石油醚和乙酸乙酯部位(1.0 g/kg,i.g.)均可显著减少水迷宫训练后期的逃避潜伏期、增加空间探索期间的平台象限的停留时间和平台穿梭次数,延长避暗试验中的逃避潜伏期、改善海马CA1、CA3区神经的损伤;然而,正丁醇和水提部位与模型组之间无显著差异。(3)HAS高、中、低剂量均能减少小鼠水迷宫训练期的逃避潜伏期,增加空间探索期间的象限停留时间和穿过平台次数,避暗试验的逃避潜伏期也明显增加,海马CA1、CA3区神经的受损得到改善等。HAS可抑制海马神经元AChE活性,蛋白免疫印迹(Western blotting),实时荧光定量聚合酶链式反应(qRTPCR),免疫组化染色等实验结果表明HAS改善小鼠学习记忆能力与增加海马区的BDNF和p-CREB mRNA表达水平及蛋白表达有关。(4)稳定性实验结果表明,紫外光、高温(80℃)、强酸(pH=2)、强碱(pH=12)对HAS的稳定性影响比较大,含量降解高达58.0%左右;HAS在人工肠液中稳定性较好;然而,置于人工胃液中8 h内,HAS的剩余百分量仅为17.8%,说明人工胃液对HAS的稳定性影响较大。结论:本课题通过东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍病理模型,发现花椒主要成分,HAS具有一定的改善学习记忆障碍的药理活性;其作用机制与激活胆碱能及CREB/BDNF信号通路有关;HAS是一个对酸、碱环境极为敏感的成分,可考虑将其制备成微囊、环糊精包合物等,确保其生物活性。