肾综合征出血热(HFRS)是一种由汉坦病毒属病毒引起，临床上主要表现为发热、出血和肾功能损害的急性病毒性传染病。我国是世界上HFRS疫情最为严重的国家，年发病人数为5-10万人，临床病情严重，病死率较高。目前尚无HFRS特异性治疗药物，预防性疫苗也还在试验中，HFRS的发病机理尚未最后阐明。 汉坦病毒有不同的型别，在我国流行的主要是汉滩型和汉城型。该病毒是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，基因组分为大(L)、中(M)、小(S)3个节段，分别编码病毒的RNA依赖的RNA聚合酶、囊膜糖蛋白(G1和G2)以及核蛋白(NP)。研究表明，汉坦病毒的M基因编码的囊膜糖蛋白(GP)可刺激机体产生中和抗体，而对感染动物和人体起到保护作用；但GP免疫原性较弱，刺激产生的抗体出现晚，滴度不高。NP是该病毒结构蛋白中免疫原性最强的，其刺激机体产生的特异性抗体出现早、滴度高、维持时间长，并且还有诱导机体细胞 第四军医大学博士学位论文免疫应答的作用。 因此，汉坦病毒GP和NP在诱导机体免疫应答中可能均起重要作用，如何发挥汉坦病毒不同结构蛋白在诱导机体免疫应答中的优势互补作用，是HFRS基因工程疫苗研究中亟待解决的问题。 本研究在本室前期工作基础上，将汉滩病毒（HTNV）76一吕株编码 GI、GZ糖蛋白的M基因片段分别与编码NP氨基端aa 1247的S基因片段p．刀拼接，利用杆状病毒和腺病毒表达系统进行融合表达以及表达产物的免疫学分析。 l、成功构建了含有 HTNV GZSO．7嵌合基因片段的重组杆状病毒转移载体pFBHTa－GZSO＊，并用 CaCI。法转化 DH OBac，获得重组 Bacmid DNA，然后用LipofectAMINE jL转染sN昆虫细胞，获得重组杆状病毒Bac－GZSO．7并进行了初步鉴定。PCR、IFA、夹心ELISA及Western－blot证实重组杆状病毒成功感染sN细胞，并在细胞中有明显目的蛋白的表达。 2、将 PCR获得的含 HTNV GISO．7和 GZSO．7俄合基因片段分别克隆到腺病毒转移载体pshuttle中，然后通过特异性的ICeul和P！S 酶切后将重组转移载体与 Adeno－X载体病毒 DNA相连，电转化 E．colt JM 09并用特异 PCR进行了筛选和鉴定，获得重组腺病毒Adeno－GI SO．7和Adeno－GZSO．7的DNA，Pac！线性化后转染HEK293细胞得到重组腺病毒原种。进一步对重组腺病毒滴度和分别感染 HEK 293 和 Vero－E6 细胞的结果进行了 ELISA、IFA 和Western－blot初步分析，证实成功获得重组腺病毒，并且目的基因能在靶细胞中有效表达，具有良好的体外免疫学活性。 3、分别以重组Bac－GISO．7和 Bac－GZSO．7杆状病毒感染sfg细胞裂解液粗蛋白免疫小鼠，以重组 Adeno－GI SO．7 FI Adeno－G2507腺病毒腹腔注射免疫Balb／c小鼠，然后以IFA、ELISA、微量细胞培养中和试验及T淋巴细胞增殖试验检测免疫效果。结果显示：口）Bac－G旧0．7和 Bac－GZSO．7感染妞细胞裂解液免疫可刺激小鼠产叫二高滴度的 NP特异性结合抗体，效价可达到 1：3200以上，而针对＊卜的效价也可达到1：200，表明机体对GP和＊P片段均产生免疫 一4． 第四军医大学博士学位论文反应。两组融合蛋白还均可刺激机体产生低水平O：20）的中和抗体和明确的淋巴细胞增殖反应。p）Adeno－GI SO．7和 Adeno－GZSO．7重组腺病毒免疫均可刺激小鼠产生低滴度的抗NP口：160和 1：320）和抗GP抗体（：20和 1：40X 同时也可产生效价约1：5刁＊ 的低滴度中和抗体并刺激T淋巴细胞增殖反应。 本研究结果表明，无论是杆状病毒还是腺病毒表达系统均能在靶细胞或动物体内成功表达 HTNV 76－118株 GI SO．7和 GZSO．7嵌合基因；无论是融合蛋白免疫还是重组病毒直接免疫，II TNTNV 76－118株GI SO．7和GZSO．7 M合基因或融合蛋白均能有效刺激机体的体液免疫和细胞免疫应答。随着两种表达系统的不断发展和完善，随着靶基因的改造和修饰技术的不断进步，使用嵌合基因及其编码融合蛋白免疫的策略将有可能为发展为一种有效的预防HFRS的基因工程疫苗提供有用的理论依据和实验基础。