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金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌是两类严重威胁食品安全的致病菌,由两种致病菌造成的中毒事件较多。目前传统微生物检测鉴定既费时又费力,基于聚合酶链式反应的方法是灵敏度高,但依赖于精密、昂贵的设备和专业操作人员,限制了其应用。本研究中建立了重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)和试纸条(LF)结合的方法,用于快速检测金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌,该方法操作简便,灵敏度高,特异性强。RPA是一种新型的扩增方法,可以在较低的温度下(37℃～42℃)下,，220min内完成检测,是被称为最接近“等温扩增”的方法。本实验以金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌特异基因为模板设计引物,将正反引物分别标记地高辛(digoxin)和生物素(biotin),经RPA扩增后生成双标记的DNA产物,其与胶体金或彩色乳胶微球标记的抗digoxin抗体发生相互作用后携带有显色物质,最终可以在LF上出现肉眼可见的结果。本研究对RPA-LF检测金黄色葡萄球菌的条件进行了优化,结果显示RPA扩增金黄色葡萄球菌的最佳条件为40℃扩增10min,灵敏度分析结果显示RPA-LF可检测500 fg DNA和1.2 X 101 CFU/mL金黄色葡萄球菌纯菌液;特异性结果显示RPA-LF特异性良好,对表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肠炎沙门氏菌等均没有交叉反应;利用鸡肉、牛奶、鸡蛋等实际样品检验方法的检测效果,结果显示经过增菌和检测后,在4.5小时内可检出食品样品中1.2×100CFU/mL(g)的金黄色葡萄球菌。本研究同样优化了 RPA-LF检测单增李斯特菌的方法,结果显示RPA扩增单增李斯特菌的最佳条件为39℃扩增10 min;灵敏度分析结果显示RPA-LF可检测300 fg基因组DNA和1.5 X 101CFU/mL单增李斯特菌纯菌液;特异性结果显示RPA-LF未与格氏李斯特菌、西尔李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、霍乱沙门氏菌和志贺氏菌发生交叉反应;用食物样品评估RPA-LF检测效果,结果显示增菌6 h后,检测限为1.5×100CFU/mL(g)。重组聚合酶恒温扩增结合试纸条检测具有快速、高特异性和高灵敏度等优点。实际样品的检测过程仅需4.5～6h,不需要复杂的热循环装置,只需一台简单的数字化水浴锅即可完成检测,同时对操作人员的技术要求不高,非常适用于食品企业和偏远地区致病菌的快速检测。