三角褐指藻是一种具有重要经济价值和生态学意义的多形态单细胞硅藻。该藻生长在海洋或盐湖中,可以合成和累积岩藻黄质,金藻昆布糖,多不饱和脂肪酸等高价值化合物。此外,由于三角褐指藻生长速度快、不占用淡水资源、能够积累自身干重20%-30%的油脂,该藻已经成为潜在的生物柴油资源藻种。近年来,由于核基因组、叶绿体基因组、线粒体基因组、蛋白质组研究成果的积累和完善,三角褐指藻已经成为研究硅藻遗传学、生理学以及生化过程的―模型生物‖。在本文中,作者研究了三角褐指藻的无菌化培养;对基因枪转化以及转化子筛选方法进行了优化;敲低了内源Pt PEPC1和Pt PEPC2基因转录;将At LEC1和At LEC1-LIKE(At L1L)转录因子密码子优化后进行异源表达,最终获得了油脂含量显著提高的转化藻株。经系统的研究,形成了三角褐指藻遗传转化的高效实验研究体系。具体研究结果如下:1、建立了三角褐指藻的无菌纯化方法采用不同浓度的四种抗生素处理含有伴生菌的三角褐指藻藻液。Ampicillin(Amp)组对三角褐指藻细胞的生长以及相关生理生化指标没有显著性影响。在除菌方面,Amp的效价较低,在浓度400mg/L时仍存在大量的伴生菌。Chloramphenicol(Cmp)在低浓度(50 mg/L)时对于三角褐指藻生长具有促进作用,而高浓度(100～400 mg/L)时具有抑制作用;叶绿素荧光参数分析显示Cmp组所有浓度均对藻细胞具有毒性刺激作用,HPLC分析显示Cmp提高了藻细胞叶绿素a在光合色素中所占的比例。藻细胞与伴生菌对于Tetracycline(Tet)的耐受性是接近一致的,即菌藻在低浓度(50～100 mg/L)Tet下可以生长,在高浓度(200～400 mg/L)Tet下生长完全被抑制。Kanamycin(Kan)对于藻细胞生长无抑制作用,甚至在高浓度(400 mg/L)下可以促进藻细胞生长,400 mg/L Kan组Fv/Fm值始终高于对照组。在除菌方面,100 mg/L Kan即可完全除去培养基中的伴生菌,SYBR GREEN I染色法也验证了Kan的除菌效果。因此,大于100 mg/L浓度的Kan最适合用作三角褐指藻的除菌剂,对藻细胞生长没有明显影响。2、建立了微藻高效基因枪转化方法对抗生素选择培养基的改良,微载体的选择、制备、包埋、点膜和轰击参数的优化,以及受体细胞的处理等进行了系统研究。结果显示,采用50%海水盐度f/2培养基可以提高博来霉素的效价,f/2固体培养基中2216E营养物质的加入能缩短1/3的平板筛选时间。微载体制备应选择对金(钨)粉没有吸附作用的离心管,制备量/管应少于3.5 mg。微载体轰击量每次大约为0.75 mg,过量将会造成一个轰击死亡圈,过少将导致轰击成本上升。当轰击间距A为6.35 mm,间距B为11 mm,间距C为6 cm时,可以获得最多的转化细胞。109个受体细胞铺成较厚的多细胞层能显著提高转化效率。经过上述优化与改进,将现有文献报道的硅藻转化效率提高了4.7～30倍,达到295±60个转化子/μg DNA。该方法也成功应用于其他微藻(杜氏盐藻、小球藻)的基因枪转化研究,为微藻基因工程研究提供高效和可靠的操作技术。3、优化了微藻藻液直接PCR法采用单因素方差分析藻细胞裂解液种类、藻细胞数、藻细胞生长阶段和煮沸裂解时间对PCR关键性因素——藻液DNA含量的影响。结果显示5种藻细胞裂解液产生的藻液DNA含量具有显著性差异;藻细胞数量的增加会导致藻液DNA含量的非线性递增;对数生长期的藻细胞产生的藻液DNA含量显著性高于稳定期和衰亡期;煮沸裂解时间在5min～15min内对藻液DNA含量影响相对较小。在进行藻液PCR时,多次取样裂解得到的藻液DNA含量由于前3个因素的不同而差异显著。PCR反应结果显示藻液DNA的加入量在50ng～200ng之间才会产生清晰明亮的条带,而裂解液自身对PCR产物的影响可以忽略不计(20μl反应体系)。根据上述实验结果,作者认为传统的藻液PCR法应加入测量藻液DNA浓度,计算加入模板体积这一关键步骤,这样可以避免假阴性结果的出现,大大提高实验的成功率。4、沉默Pt PEPC1和Pt PEPC2基因提高三角褐指藻脂质含量从三角褐指藻中克隆获得两个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Pt PEPC1和Pt PEPC2,分别在这两个基因的酶活性中心保守序列设计反向重复的RNA干扰结构。转化后,得到了Pt PEPC1和Pt PEPC2基因干扰转化子。转化子无论在m RNA转录水平上,还是在PEPC酶活性上,均显示大幅下降。生理生化参数分析显示,干扰转化子最大细胞密度比野生型藻株降低8%～12%,Fv/Fm在对数生长期时(第8天)较野生型降低约5%,在稳定期时(第14天)降低约20%。干扰转化子r ETR值与野生型没有显著性差异,非光化学淬灭较野生型下降16%～31%。本研究证明了三角褐指藻不存在C4途径,而只存在有助于细胞消耗过剩光能的“C4代谢”。此外,干扰转化子中性脂含量提高18～22%,间接证明了“底物竞争”假说。5、过表达外源At LEC1和At L1L转录因子提高三角褐指藻脂质含量将At LEC1和At L1L转录因子进行密码子优化后,分别转入三角褐指藻细胞中。亚细胞定位显示转录因子定位于细胞核。Southern和Western杂交结果表明外源基因已整合进入三角褐指藻核基因组中,并且可以在藻细胞中稳定地表达。转化子在培养周期内与野生型藻细胞生长情况接近,最大细胞密度没有显著性差异。At LEC1转化子中性脂含量提高15%～24%,At L1L转化子中性脂含量提高42%～64%。转录组测序分析表明,过表达At L1L转录因子藻株中1876个基因表达发生显著性变化,其中1512个基因上调,364个基因下调。上调表达的基因涉及脂肪酸合成,甘油酯代谢,糖酵解,丙酮酸代谢等途径。代谢组学分析显示At L1L转化子中葡萄糖,果糖和甘露糖等单糖含量显著性下降,丙酮酸,苹果酸,琥珀酸和延胡索酸等有机酸以及脂质合成原料乙酰辅酶A,丙二酰辅酶A,甘油-3-磷酸的含量显著性提高。本研究的结果表明At L1L转录因子通过调控糖酵解、脂质合成途径相关基因,限制了光合固定的碳向糖类合成方向流动,这些碳被―虹吸‖进入脂质合成,进而造成转化株油脂积累的大幅提高。