研究背景创伤愈合过程是一个完整、动态的过程,基本分为三个互相重叠的阶段:炎症反应、组织细胞增殖和重塑期。炎症反应期是创面修复最早发生并且最重要的阶段,决定着愈合过程能否顺利进入增殖和重塑期,并完成正常的愈合。目前已知多种免疫细胞参与了该阶段的修复,如中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞等。中性粒细胞和巨噬细胞的重要作用已基本明确,然而淋巴细胞在创面修复中的作用研究较少。尽管目前相关研究已表明淋巴细胞的一个亚型γδT淋巴细胞在皮肤中存在定植,并在维持皮肤的稳态中发挥着重要作用,但其在创面修复中具体的作用及其机制仍未明确。多个研究表明γδT细胞一些皮肤炎性疾病或者免疫性疾病的皮肤改变相关,如银屑病、系统性红斑狼疮等。这提示我们γδT细胞可能参与了创面愈合过程,并在炎性反应中发挥重要的角色。另一方面,γδT细胞缺陷的小鼠皮肤表现出皮肤更加平坦,角蛋白细胞减少,皮肤表皮层变薄等改变,而肥胖的小鼠皮肤γδT细胞调节皮肤稳态功能减弱,并表现出与γδT细胞缺陷的小鼠皮肤相似的结构改变。因此我们推测糖尿病小鼠和患者的上皮层变薄是否与γδT细胞的数量或功能缺陷相关,这也进一步提示我们皮肤中γδT细胞的异常可能是糖尿病慢性创面的影响因素之一。本研究拟在验证γδT细胞在小鼠及人皮肤中存在定植的基础上,通过建立小鼠背部皮肤三度烧伤模型探讨γδT细胞在创面愈合中的动态变化,并进一步明确γδT细胞在糖尿病难愈创面形成中的作用。目的观察γδT细胞在创面愈合中的动态变化,探讨γδT细胞在糖尿病难愈创面形成中的作用。方法第一部分:选取小鼠背部皮肤,通过免疫组化技术验证γδT淋巴细胞在皮肤组织中的表达,应用激光扫描共聚焦显微镜(Laser scan microscope,LSM)在体动态观察CXCR6-GFP转基因小鼠(皮肤的γδT细胞表达GFP)皮肤中γδT淋巴细胞在皮肤组织中的空间分布和随时间的动态变化情况。同时,收集患者的正常皮肤组织,通过免疫组化染色观察γδT淋巴细胞在人皮肤组织中的表达情况。第二部分:建立小鼠背部皮肤三度烫伤模型,并通过创面组织HE染色验证模型。观察创面的愈合过程,应用免疫组织化学技术检测γδT细胞在创面愈合过程中的动态变化。同时,应用ELISA和Real-time PCR技术分别在蛋白和基因水平检测γδT细胞相关的细胞因子(IGF-1、FGF-7、FGF-10)在创面愈合过程中的表达变化。另一方面,收集临床患者的皮肤组织标本,并通过免疫组织化学技术检测γδTCR在创面组织中的表达。第三部分:建立糖尿病小鼠背部皮肤三度烧伤创面模型,观察创面的愈合时间。应用免疫组织化学检测创面组织中γδTCR的表达,同时应用ELISA和Real-time PCR技术检测γδT细胞相关的细胞因子的蛋白(IGF-1、FGF-7、FGF-10)和基因(igf-1、fgf-7、fgf-10、jaml)表达,并观察以上指标在创面愈合过程中表达的变化。而且,收集临床糖尿病和非糖尿病患者的慢性创面组织,通过免疫组织化学染色观察了γδTCR在糖尿病患者慢性创面组织中的表达变化。结果第一部分:小鼠皮肤中有γδT细胞的定植,表皮层的γδT细胞居多,形态类似DC,有很多树突,可在皮肤表面约33μm观察到,少量位于真皮浅层的(约58μm处)γδT细胞则没有树突,形态类似循环中的αβT细胞。通过动态观察发现真皮层中的γδT细胞在无任何刺激因素下即以较快的速度移动(约4μm/min),而表皮层的γδT细胞则始终保持静止状态。γδT细胞在人的皮肤组织的分布与小鼠γδT细胞在小鼠皮肤中的表达相似,γδTCR阳性的淋巴细胞主要存在于人皮肤组织的表皮层。然而,尽管γδTCR在人真皮层表达比在小鼠真皮层的表达增多。第二部分:小鼠烧伤皮肤表现及HE染色显示成功建立三度烧伤模型。免疫组织化学方法检测创面组织中γδTCR阳性的淋巴细胞表达变化,结果显示正常皮肤中阳性表达的细胞量较少,烧伤后3dγδTCR阳性的细胞数量开始增加,5d,7d以及10d表达水平明显增高,烧伤后14d阳性细胞数达到高峰,以后表达水平开始下降,直到烧伤后21dγδTCR阳性的细胞数量明显减少。小鼠烧伤创面组织中FGF-7、FGF-10和IGF-1的含量均在烧伤后3d开始增高,烧伤后表达5d达到高峰,7d有所下降,在烧伤后10d蛋白含量较前进一步降低,28d时蛋白含量恢复至0d的水平或较0d稍高水平。Real-time PCR检测小鼠创面组织中fgf-7、fgf-10、igf-1、jaml等基因的表达,结果与免疫组织结果一致,基因的表达在烧伤后3d开始增高,5d,7d,10d维持在高表达水平,烧伤后14d较前表达降低,烧伤后28d基本恢复至正常组织表达水平。临床患者的急性皮肤创面组织中γδT淋巴细胞数量明显多于正常的皮肤组织。第三部分:db/db小鼠烧伤创面的愈合时间较db/m小鼠明显延长(37.2±4.11 d vs 28.2±3.75 d)。免疫组织化学染色结果显示,在db/db小鼠烧伤创面的愈合过程中,γδTCR阳性的淋巴细胞同样表现为动态的改变,但与对照组db/m小鼠变化趋势不同,烧伤后1dγδT淋巴细胞较少,3d开始逐渐增多,烧伤后7d,10d,14dγδTCR阳性的淋巴细胞数目明显增多,并维持高表达水平,烧伤后21d仍无明显减少。并且,γδT淋巴细胞在db/db小鼠烧伤创面愈合3d,7d,10d,14d的表达均比在db/m小鼠减少。ELISA和Real-time PCR检测γδT淋巴细胞分泌的一些细胞因子的蛋白及基因的表达,结果均显示db/m小鼠烧伤后各因子表达在5d,7d达到高峰,10d开始下降,烧伤后28d表达明显下降至接近正常水平,而db/db小鼠烧伤后相关蛋白或基因的表达逐渐上升,10d,14d达到高峰,28d仍维持高水平表达。对临床患者创面组织中的γδTCR进行免疫组化染色,结果显示无论糖尿病和非糖尿病患者中,创面组织中γδTCR阳性的细胞数均高于其在正常组织中的表达,而在创面组织中的γδTCR阳性细胞数,糖尿病患者明显低于非糖尿病患者。结论1.γδT淋巴细胞在皮肤组织的表皮层和真皮层均有定植,但在人和小鼠皮肤中的分布不完全相同;2.γδT细胞参与了创面的愈合过程;3.γδT细胞与糖尿病难愈创面的形成相关。