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黑色素在生物界普遍存在,具有防止蛋白质降解、光子屏蔽、化学保护等作用,特别是它对紫外线和辐射具有抵抗性。苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis能够形成具有杀虫活性伴胞晶体的革兰氏阳性菌,作为广泛应用的生物杀虫剂有其自身的缺陷。其一,杀虫晶体蛋白在施用时易受到阳光中紫外线的破坏,影响效果,黑色素成为解决晶体蛋白阳光损害这一问题的有效办法；其二,B. thuringiensis可以形成多种晶体蛋白,但每一种都有其自身特定杀虫范围,人们期待按照需要构建具有特定杀虫活性的重组菌。因此,获得既产黑色素又可按照需要表达各种晶体蛋白的菌株成为解决这一问题的可行办法。苏云金芽胞杆菌绝大部分菌株具有产黑色素的潜力,只要通过高温42℃的诱导,便可诱导产黑表型。为了探究高温诱导产黑色素调控机理,采用两条路线：其一,利用mini-Tn10转座子载体pIC333构建突变子库,筛选产黑色素表型发生变化的突变株。其二,构建敲除载体,对黑色素相关基因进行定向敲除。本论文主要对苏云金芽胞杆菌高产黑色素突变菌株及黑色素相关基因进行了以下研究。1.通过高温诱导传代培养,得到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171的高产黑色素突变株BMB181。BMB181高产黑色素达到8.55 mg/mL,根据文献报道,这是产黑色素最高的苏云金芽胞杆菌。在不添加酪氨酸的培养基上BMB181也可产生黑色素。BMB181在发酵培养基中同样可产生黑色素,经测定产黑量达到4.66mg/mL。BMB181转化效率达到106 cfu/μg。经光学显微镜以及SDS-PAGE实验观察,BMB181能够有效表达对鳞翅目具有高毒力的杀虫晶体蛋白Cry1Ac10。生测结果显示经过4h紫外线照射,重组菌BMB32(cry1Ac10/BMB181)对棉铃虫的LC50是1.37μg/mL,而BMB31(cry1Ac10/BMB171) LC50为25.85μg/mL。以上研究结果显示,BMB181是构建具有紫外抗性B. thuringiensis制剂的良好宿主菌。2.利用mini-Tn10转座子载体pIC333构建苏云金芽胞杆菌油松亚种4CA1随机插入突变体库。在加入1%酪氨酸的LB培养基上,筛选得到一株在42℃产黑减弱的菌株。测序得到中断基因序列,经NCBI序列比对分析,确定中断基因为超氧化物歧化酶基因sodA2。为验证该基因同产黑色素之间的关系,构建了超氧化物歧化酶基因敲除载体pBMB1252,在4CA1中进行了该基因的敲除工作。初步得到卡那霉素抗性突变株,在进行进一步验证时遇到困难。经csab基因验证抗性突变株为4CA1突变株。后经PCR扩增证实在该突变株中能够扩增得到卡那抗性基因,而不能扩增得到敲除载体pBMB1252的序列。对抗性突变株进行产黑色素性状检测发现,4CA1抗性突变株42℃产黑色素性状减弱。由实验结果推断菌株获得卡那抗性基因片段,产黑色素性状突变原因还需进一步研究。3.根据文献报道,苏云金芽胞杆菌产生黑色素的关键基因是酪氨酸酶基因。通过PCR扩增证实,该基因在实验室保藏的约100株已知血清型的苏云金芽胞杆菌中普遍存在。苏云金芽胞杆菌油松亚种4CA1在42℃产黑色素比较明显,但在其基因组中不能扩增得到酪氨酸酶基因。在常温产黑色素不明显的BMB171和常温产黑色素明显的BMB181突变株中均能扩增得到该基因。为了证实苏云金芽胞杆菌酪氨酸酶基因在控制黑色素合成中的作用,以及苏云金芽胞杆菌是否存在其它产黑路径,构建了该基因的敲除载体pBMB1251,在苏云金芽胞杆菌BMB171和BMB181中进行了该基因敲除,分别得到敲除了该基因的突变株BMB1225和BMB1226。对酪氨酸酶基因突变株产黑色素能力进行了测定,证实突变株与亲本产黑色素没有差异。进一步生物信息学分析,发现BMB171菌株中存在一个ORF含有漆酶保守结构域。这为推论苏云金芽胞杆菌中可能存在其它产黑路径提供了进一步证据。