(一) 斑马鱼是研究脊椎动物胚胎发育理想的模式生物。整胚原位杂交和显微注射转基因技术是斑马鱼基因功能研究中两种重要的研究方法。本部分以造血系统特异性基因GATA-1和biklf的cDNA片段为模板体外转录地高辛标记的反义RNA探针进行了整胚原位杂交。结果显示它们都在血液系统发育过程中有强烈表达,但GATA-1仅在血细胞中表达,而且开始表达的阶段较晚。biklf较早开始表达,在中囊胚转换完成后就启动表达了,而且除在血液系统中有表达外,在外胚层组织也有一定表达。 分别将病毒启动子CMV和斑马鱼血细胞特异性表达基因GATA-1的启动子驱动的报告基因EGFP表达载体通过显微注射转入斑马鱼胚胎,观察了报告基因EGFP的表达情况。CMV启动子驱动的EGFP在斑马鱼发育的过程中广泛表达。而GATA-1启动子驱动的报告基因表达模式与其内源基因的表达模式基本一致,仅局限于血细胞前体和成熟血细胞中。这表明我们已经成功地建立了斑马鱼整胚原位杂交和显微注射转基因技术平台,为深入开展发育相关基因功能研究奠定了基础。 (二) SM22α是一种大小为22-kDa的细胞骨架相关蛋白。它在各种脊椎动物胚胎发育过程中及成年动物的平滑肌组织中特异性表达。本部分报道了斑马鱼SM22α基因的克隆及它在胚胎发育过程中的表达模式,并通过吗啉修饰的反义寡核苷酸介导的基因抑制深入研究了该基因在斑马鱼胚胎发育过程中的功能。 斑马鱼SM22α基因全长cDNA的长度为1296bp,其中的开放阅读框编码了一条含有201个氨基酸残基的多肽。该基因表达产物在氨基酸水平上与人、小鼠、大鼠、鸡和牛的SM22α基因产物分别有69.2%、69.7%、69.2%、67.2%和61.2%的相似性。其中包含有与结合细胞骨架α-actin相关的CH结构域和Calponin串联重复序列,并在179位包含一个蛋白激酶C的靶位点。该基因由5个外显子和4个内含子组成,覆盖了长约7.7kb的基因组区域,其中起始密码子落在第2外显子上。 整胚原位杂交结果显示该基因最早主要在50%外包期的前脊索盘中表达,既而迁移到原肛处。随着血管系统的发生,该基因在背动脉、轴静脉、体节间血管等血管系统出现广泛的高表达。同时它在肠、表皮、胸鳍、骺等组织也有表达。至受精后三天,该基因在血管系统中的表达减弱,而在肠、消化道和鳃弓等处的表达增强。 为了研究SM22α基因在斑马鱼胚胎发育过程中的功能,采用吗啉修饰的反义RNA