【摘 要】
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干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节活性的糖蛋白。近年来,重组α-干扰素已经被用于犬、猫、猪、鸡等病毒性传染病的预防和治疗,但有关雷州山羊α-干扰素基因的遗传变异、重组山羊α-干扰素的抗病毒活性的报道较少。本研究通过克隆雷州山羊α-干扰素基因,分析其遗传变异;将其成熟肽编码序列导入大肠杆菌表达,制备重组α-干扰素成熟肽并检测其抗小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GPV)活性,旨在为山羊病
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干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节活性的糖蛋白。近年来,重组α-干扰素已经被用于犬、猫、猪、鸡等病毒性传染病的预防和治疗,但有关雷州山羊α-干扰素基因的遗传变异、重组山羊α-干扰素的抗病毒活性的报道较少。本研究通过克隆雷州山羊α-干扰素基因,分析其遗传变异;将其成熟肽编码序列导入大肠杆菌表达,制备重组α-干扰素成熟肽并检测其抗小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GPV)活性,旨在为山羊病毒性传染病的防治提供新的途径。为了研究雷州山羊α-干扰素基因的遗传变异,从临床健康山羊外周血分离外周血单核细胞,提取细胞总RNA,利用RT-PCR技术扩增山羊α-干扰素基因,分析其遗传变异。结果显示:(1)雷州山羊α-干扰素全基因由570个核苷酸组成,编码189个氨基酸;与Gen Bank上发表的山羊、黄牛、林麝、弯角大羚羊、瘤牛、绵羊、猪、人和鼠的核苷酸序列同源性分别为99.8%、94.7%、95.6%、96.8%、94.7%、96.8%、81.6%、77.8%和70.0%;氨基酸序列同源性分别为100%、92.1%、92.6%、94.7%、93.2%、93.7%、67.9%、61.6%和55.3%,提示反刍动物的α-干扰素基因核苷酸和氨基酸序列高度保守,亲缘关系较远的动物种属之间α-干扰素基因序列存在较大差异。(2)雷州山羊α-干扰素信号肽潜在裂解位点位于N末端22~23个氨基酸之间,其成熟肽由167个氨基酸组成,无N-糖基化位点,可能存在4个潜O-糖基化位点。为了研究重组山羊α-干扰素的抗病毒活性,利用PCR技术扩增山羊α-干扰素基因成熟肽编码序列,与表达载体p ET-32a(+)连接,构建原核表达载体p ET-m IFN-α,并在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,通过比较不同表达时间、表达温度和诱导剂浓度对重组α-干扰素成熟肽表达量的影响,确定当以终浓度0.5mmol/L IPTG作诱导剂在37℃持续诱导6h时,重组蛋白表达量最高,且主要以包涵体形式存在,利用SDS-PAGE和Western-blot技术对重组蛋白进行检测,结果均显示r G-m IFN-α分子量大小约32k Da。重组蛋白经8mol/L尿素变性,变性的r G-m IFN-α依次用3、2、1、0.5mol/L进行复性处理,复性后的r G-m IFN-α采用NTA-Ni2+纯化。通过细胞病变抑制法测定其抗小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GPV)活性。结果表明,重组山羊α-干扰素能显著抑制PPRV和GPV感染引起的细胞病变,其抗PPRV和GPV效价分别为1.6×10~4U/mg和1.35×10~4U/mg。
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