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第一部分细胞内AGR2促进SNAIL/SLUG介导的结直肠癌细胞EMT和迁移目的:分析AGR2表达对结直肠癌细胞上皮间质转化（EMT）进程的影响,分析细胞外及细胞内AGR2对SNAIL和SLUG表达的影响。方法:利用半定量PCR（semi-quantitative RT-PCR）和Western blot检测人6种结直肠癌细胞系（Lo Vo、SW480、SW48、HCT116、DLD-1和HT-29）中AGR2的表达水平。根据以上检测结果,利用慢病毒感染技术构建AGR2稳定过表达的Lo Vo和SW480细胞系及AGR2稳定敲减的DLD-1和HT-29细胞系。本课题组前期利用CRISPR/Cas9系统构建了AGR2敲除（knock out）的HT-29（HT-29AGR2-KO）细胞系和对照细胞（HT-29Ctrl）。Transwell迁移实验检测AGR2表达水平对上述细胞迁移能力的影响。利用荧光实时定量PCR（q RT-PCR）,Western blot和免疫荧光染色检测上述细胞中AGR2表达水平对上皮组织的标志基因E-cadherin、ZO-1,间质组织的标志基因N-cadherin、CLDN1和EMT相关的转录因子SNAIL、SLUG、TWIST、ZEB1和ZEB2表达水平的影响。利用慢病毒感染技术在AGR2稳定过表达的基础上构建SNAIL或SLUG稳定敲减的结直肠癌细胞系,Transwell迁移实验检测以上细胞的迁移能力,同时利用Western blot检测E-cadherin和ZO-1的表达水平。收集AGR2稳定过表达的Lo Vo和SW480细胞条件性培养基（conditioned medium,CM）,有机溶剂沉淀法提取上清中的蛋白质后Western blot检测AGR2的表达水平。利用共聚焦显微镜观察Lo Vo细胞中AGR2与内质网（ER）的定位情况。收集AGR2稳定过表达及对照的Lo Vo和SW480细胞的CM,用其处理野生型Lo Vo和SW480细胞;此外,在AGR2稳定过表达及对照Lo Vo和SW480细胞中加入AGR2的中和抗体处理。Western blot和Transwell迁移实验分别检测细胞外AGR2（e AGR2）和细胞内AGR2（i AGR2）对SNAIL/SLUG的表达和细胞迁移能力的影响。用高尔基体蛋白运输抑制剂（Golgi stop,主要成分为莫能霉素,Monensin）阻断AGR2的分泌,检测细胞内AGR2对SNAIL和SLUG表达水平的影响。结论:细胞内AGR2通过上调SNAIL和SLUG的表达而促进结直肠癌细胞的EMT进程和迁移。第二部分细胞内AGR2通过激活KDELR-Gs-PKA信号通路调节REL和组蛋白乙酰化而共同促进SNAIL和SLUG的表达目的:探索细胞内AGR2促进SNAIL和SLUG表达的具体分子机制。方法:构建野生型（WT）、N端信号肽截短型（△S）和C端KTEL序列截短型（△KTEL）AGR2表达质粒,转染Lo Vo和SW480细胞后检测AGR2信号肽和KTEL序列对细胞内、外AGR2表达量,SNAIL/SLUG的表达和细胞迁移能力的影响。在293T细胞中采用免疫共沉淀（CO-IP）的方法检测外源性过表达的AGR2与KDEL受体（KDELR1/2/3）的结合。在DLD-1和HT-29细胞中采用CO-IP的方法检测内源性表达的AGR2与KDELR1/2/3的结合。利用q RT-PCR检测AGR2过表达对KDELR1/2/3的表达水平的影响。利用si RNA和sh RNA在AGR2稳定过表达的Lo Vo细胞中分别敲低KDELR1、2、3的表达,检测KDELR敲减对AGR2诱导的SNAIL/SLUG表达和细胞迁移能力的影响。同时,将单独AGR2稳定过表达、单独KDELR1稳定敲减和AGR2稳定过表达同时KDELR1稳定敲减的Lo Vo细胞尾静脉注射裸鼠构建转移模型,观察小鼠肝肺转移灶,记录生存期,体内检测KDELR对i AGR2促进CRC转移的影响。在AGR2稳定过表达的CRC细胞中利用si RNA敲减Gs,或者用抑制剂H89抑制PKA活性,Western blot和Transwell迁移实验分别检测SNAIL/SLUG表达和细胞迁移能力。利用免疫荧光实验检测AGR2稳定过表达及对照细胞中PKA催化亚基（PKAcat）的入核情况。AGR2稳定过表达的Lo Vo细胞中转染SNAIL或SLUG的启动子荧光素酶报告质粒,检测AGR2对SNAIL和SLUG转录水平的影响。通过生物信息学软件分析预测SNAIL和SLUG启动子上可能结合的转录因子,筛选出REL后构建REL的表达质粒,并在Lo Vo细胞中检测REL对SNAIL和SLUG启动子荧光素酶活性的影响。利用sh RNA敲减KDELR1或者用抑制剂H 89抑制PKA活性,Western blot检i AGR2-KDELR-Gs-PKA信号轴对REL表达的影响。利用慢病毒感染技术构建AGR2稳定过表达的同时REL稳定敲减的Lo Vo细胞,Western blot和Transwell迁移实验分别检测i AGR2诱导的SNAIL/SLUG的表达和细胞迁移是否依赖于REL。Lo Vo细胞用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的泛抑制剂帕比司他（Panobinostat）处理,q RTPCR检测SNAIL和SLUG的m RNA水平。Western blot检测AGR2稳定过表达的Lo Vo和SW480细胞中常见组蛋白乙酰化修饰位点（H3K9/14/18/27/56;H4K5/8/12;H2AK5;H2BK5）的乙酰化水平。利用si RNA敲减KDELR1/2/3、Gs或者用抑制剂H 89抑制PKA活性,Western blot检测i AGR2-KDELR-Gs-PKA信号轴对乙酰化H3K9（H3K9ac）表达水平的影响。AGR2稳定过表达及对照Lo Vo细胞中利用染色质免疫沉淀（CHIP）的方法检测SNAIL和SLUG启动子上H3K9ac的结合情况。利用q RT-PCR筛选i AGR2-KDELR信号轴调控H3K9ac表达中参与的组蛋白乙酰化转移酶（GCN5、CBP、P300、PCAF）和组蛋白去乙酰化酶（SIRT1、SIRT2、SIRT6）。AGR2稳定过表达及对照Lo Vo细胞中用抑制剂H 89抑制PKA活性,q RT-PCR检测PCAF和SIRT2的m RNA水平。利用慢病毒感染技术构建AGR2稳定过表达的同时PCAF稳定敲减,或者SIRT2稳定过表达的Lo Vo细胞,Western blot和Transwell迁移实验分别检测SNAIL/SLUG表达水平和细胞迁移能力。结论:细胞内AGR2通过与KDELR结合后激活下游Gs-PKA信号通路,进而促进REL和H3K9ac表达而促进SNAIL和SLUG的转录及CRC细胞迁移。第三部分细胞内AGR2响应巨噬细胞分泌的PGE2刺激目的:探索细胞内AGR2与肿瘤微环境中前列腺素E2（PGE2）之间的关系,并探索抑制结直肠癌转移的治疗策略。方法:用不同浓度（0、50、100、200 ng/m L）的PGE2处理Lo Vo和HT-29细胞24h,Western blot检测AGR2蛋白水平。Lo Vo、SW480、HT-29、CT26和HT-29AGR2-KO细胞用200 ng/m L PGE2处理24 h后,Western blot检测EMT相关分子E-cadherin、N-cadherin、ZO-1和SNAIL的表达。Lo Vo和HT-29细胞中转染si AGR2,24 h后加入200 ng/m L PGE2再刺激24 h,Transwell迁移实验检测细胞迁移能力。收集本院结直肠癌病人和正常志愿者的全血标本,采用Ficoll密度梯度离心法提取外周血单个核细胞（PBMCs）,体外培养12 h后收集上清,ELISA检测PGE2含量。此外,对于提取的PBMC细胞在体外培养时加入环氧合酶-2（COX2）的抑制剂塞来昔布（Celecoxib,CXB）处理,并收集上清。Lo Vo和HT-29细胞用上述上清处理24 h,Western blot检测AGR2蛋白水平,同时Transwell迁移实验检测细胞迁移能力。分离小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）,加入IL-4诱导分化为M2型巨噬细胞,加入CXB处理,并收集上清处理CT26细胞24 h,Western blot检测AGR2蛋白水平,同时Transwell迁移实验检测细胞迁移能力。Lo Vo和HT-29细胞中转染si AGR2,24 h后加入CRC病人来源的PBMCs培养上清,Transwell迁移实验检测细胞迁移能力。用PGE2（200ng/m L）处理EP4稳定敲减及对照Lo Vo和HT-29细胞24 h,Western blot检测AGR2蛋白水平。用AKT抑制剂MK2206处理Lo Vo和HT-29细胞4 h后,再加入PGE2（200 ng/m L）处理24 h,Western blot检测AGR2蛋白水平。将Agr2稳定敲减及对照CT26细胞经脾脏注射入Balb/c小鼠构建肝转移模型,随后进行100 mg/kg塞来昔布灌胃治疗,观察小鼠肝转移灶,记录生存期,同时对心脏、脾脏、肺和肾脏组织进行苏木精伊红（H＆E）染色以观察毒性。结论:巨噬细胞分泌的PGE2通过EP4-PI3K-AKT信号通路上调CRC细胞内AGR2蛋白水平而促进EMT和CRC细胞迁移。