研究背景乳腺癌(breast cancer,BC)是世界范围内女性最常见的癌症。BC是一种复杂的异质性疾病,根据组织学特征可分为激素受体阳性、人表皮生长因子受体2 阳性(human epidermal growth factor receptor-2 overexpressing,HER2+)和三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)。诱发BC的因素具有多样性,如人工流产、用枸橼酸氯米芬和促性腺激素等诱导排卵、电离辐射以及酗酒和吸烟等。由于女性对乳房的自我检查和临床检查的疏忽,乳腺癌很难在早期被发现,从而耽误患者的及时治疗。因此,通过早期检查改善BC的预后和提高生存率仍然是BC治疗的重中之重。深入探究BC的风险因子以及其内在发病机制,对于BC的预防及治疗具有深远的意义。研究目的本研究旨在探究miR-494通过介导成纤维细胞生长因子受体-2(fibroblast growth factor receptor-2,FGFR-2)对BC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭方面的影响。实验首先探讨 FGFR-2和磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha,PI3KCA)基因变异在BC中的意义及其与预后之间的关系。随后通过对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的研究,检测miR-494过表达或沉默对乳腺癌细胞MDA-MB-453和MCF-7细胞行为的影响。以miR-494和FGFR-2之间的调控关系为切入点,深入探究miR-494对BC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,对细胞凋亡的促进作用,以及对 RAS/RAF/裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信号通路和磷脂酰肌醇激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,AKT)信号通路的抑制作用。试图阐释miR-494通过介导FGFR-2对BC产生调控作用的分子机制,以期为BC的治疗提供有力的理论支持和方案策略。研究方法第一部分中国人群中FGFR-2和PI3KCA基因变异与乳腺癌风险的关系本部分实验中,首先通过对328名BC患者和389名健康对照组进行了基因分型。随后,我们评估FGFR-2 rs1219648和PI3KCA rs6443624与BC易感性和临床病理特征的相关性,包括年龄、肿瘤大小、临床分期、分级、淋巴结浸润状态、雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)以及HER2基因状态。采用log-rank检验Kaplan-Meier曲线评估FGFR-2 rs1219648和PI3KCA rs6443624与预后指标之间的相关性,以此阐述这些基因与中国女性BC患者风险和患者生存率之间的关系。在本部分实验中,采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA,进行基因分型。第二部分过表达或沉默miR-494对乳腺癌细胞MDA-MB-453和MCF-7细胞行为的影响本部分实验中,首先对 MCF-10A、SK-BR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-453、BT-549以及MCF-7等BC细胞系及BC组织中的miR-494的表达水平进行检测,根据表达水平选择MDA-MB-453和MCF-7细胞用于后续实验。随后,我们在所选的细胞中过表达或沉默miR-494,利用细胞活力以及细胞周期相关因子CyclinD1、细胞周期素依赖激酶(Cyclin Dependent Kinase,CDK)4 和 CDK6的表达,检测细胞增殖;利用细胞凋亡率以及凋亡相关因子pro-Caspase 3、Cleaved-Caspase 3和Bax的蛋白表达量,检测细胞凋亡;利用细胞迁移率、侵袭率以及相关因子基质金属蛋白酶9(Matrix Metallopeptidase 9,MMP-9)和Vimentin的蛋白表达量,检测细胞迁移和侵袭。本部分的研究中,使用qRT-PCR检测BC细胞系中miR-494表达情况;使用CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测细胞活力;使用lipofectamine 3000试剂进行细胞转染;使用碘化丙酯(propidium iodide,PI)和荧光素异硫氰酸酯(fluorescein isothiocynate,FITC)偶联Annexin V染色检测细胞凋亡率;使用双室迁移法检测细胞迁移和侵袭;使用蛋白免疫印迹分析检测CyclinDI、CDK4、CDK6、pro-Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Bax、MMP-9、Vimentin 和 β-actin 的蛋白表达。第三部分miR-494靶向FGFR-2基因抑制MDA-MB-453和MCF-7细胞行为本部分实验中,首先将miR-494 mimic或其阴性对照(negative control,NC)mimic转染至MDA-MB-453和MCF-7细胞,转染48h后检测细胞中FGFR-2的表达变化。利用双荧光素酶报告实验,检测miR-494对FGFR-2的靶向调控关系。分别用 NC mimic 和 pEX-2、miR-494 mimic 和 pEX-2 以及 miR-494 mimic 和pEX-FGFR-2共转染至MDA-MB-453和MCF-7细胞,测定细胞活力、细胞凋亡率、细胞迁移率、细胞侵袭率、细胞周期相关因子CyclinDl、CDK4和CDK6的表达变化、细胞凋亡相关因子pro-Caspase 3、Cleaved-Caspase 3和Bax的表达变化、细胞迁移和侵袭相关因子MMP-9和Vimentin的表达变化,以探究miR-494通过调控FGFR-2表达影响BC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用。最后检测RAS/RAF/MEK/ERK 信号通路核心因子(RAS、RAF、p/t-MEK 以及 p/t-ERK)以及PI3K/AKT信号通路核心因子(p/t-PI3K和p/t-AKT)的蛋白表达情况,以探究miR-494通过调控FGFR-2表达,影响BC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的分子机制。本部分的研究中,利用双荧光素酶报告实验,检测FGFR-2是否为miR-494的靶基因;使用CCK-8法检测细胞活力;使用lipofectamine 3000试剂进行细胞转染;使用FITC-膜联蛋白V/PI检测试剂盒检测细胞凋亡率;使用双室迁移法检测细胞迁移和侵袭:使用蛋白免疫印迹分析检测FGFR-2、CyclinD1、CDK4、CDK6、pro-Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Bax、MMP-9、Vimentin、和β-actin的蛋白表达。结果第一部分中国人群中FGFR-2和PI3KCA基因变异与乳腺癌风险的关系本部分实验发现,FGFR-2 rs1219648,AG等位基因与BC患者临床分期和分级均表现出显著的相关性,GG等位基因与BC患者分级显著相关。同时发现FGFR-2 rs1219648优势模型也显示与BC患者临床分级显著相关。对于PI3KCA rs6443624,其AC等位基因与临床分期显著相关,并且AA等位基因与分级显著相关。此外,PI3KCA rs6443624优势模型与临床分期显著相关。FGFR-2 rs1219648或PI3KCA rs6443624在BC患者中的预后影响检测显示,相对于FGFR-2 rs 1219648 AA等位基因的患者,AG和GG等位基因的患者生存时间更短。然而,患者PI3KCA rs6443624中显示每个等位基因之间都没有差异。除此之外,我们采用逐步Cox回归模型进行多变量分析,发现临床分期、ER和PR状态可能是重要的预后指标。第二部分过表达或沉默miR-494对乳腺癌细胞MDA-MB-453和MCF-7细胞行为的影响本部分实验发现,miR-494 在 MCF-10A、SK-BR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-453、BT-549以及MCF-7等BC细胞系及BC组织中,呈现低表达。由于实验中MDA-MB-453和MCF-7细胞中miR-494的表达量较其它细胞更低,因此选择MDA-MB-453和MCF-7细胞用于后续实验。随后我们在所选的细胞中过表达miR-494,发现miR-494过表达能够降低MDA-MB-453和MCF-7细胞的活力、增殖,并且降低细胞周期相关因子CyclinD1、CDK4和CDK6的表达;提高细胞凋亡率进而促进细胞凋亡,并且提高凋亡相关因子Cleaved-Caspase 3和Bax的蛋白表达量;降低细胞迁移率、侵袭率,并降低细胞迁移和侵袭相关因子MMP-9和Vimentin的蛋白表达。此外,实验结果显示:miR-494沉默能够提高MDA-MB-453和MCF-7细胞活力、增殖,并且促进细胞周期相关因子CyclinD 1、CDK4和CDK6的表达;对细胞凋亡影响不是很明显;促进细胞迁移率、侵袭率并促进细胞迁移和侵袭相关因子MMP-9和Vimentin的蛋白表达。第三部分miR-494靶向FGFR-2基因抑制MDA-MB-453和MCF-7细胞行为实验结果显示,miR-494过表达可以抑制MDA-MB-453和MCF-7细胞中FGFR-2的表达;双荧光素酶报告实验结果证实,FGFR-2是miR-494的一个靶基因;FGFR-2过表达能够促进MDA-MB-453和MCF-7细胞活力、细胞迁移率以及侵袭率,上调细胞周期相关因子(CyclinD1、CDK4和CDK6)、细胞迁移和侵袭相关因子MMP-9和Vimentin的蛋白表达;降低细胞凋亡率以及下调细胞凋亡相关因子(c/p-Caspase 3和Bax)的表达。此外,miR-494过表达能够下调MDA-MB-453和MCF-7细胞中RAS/RAF/MEK/ERK信号通路核心因子(RAS、RAF、p/t-MEK以及p/t-ERK)以及PI3K/AKT信号通路核心因子(p/t-P13K和p/t-AKT)的蛋白表达情况,而FGFR-2过表达能够逆转该趋势。结论本课题对miR-494通过调控FGFR-2表达抑制BC细胞的增殖、迁移、侵袭以及促进细胞凋亡的作用及分子机制进行系统的研究,得出以下结论:(1)在中国人群中,FGFR-2 rs1219648 和 PI3KCA rs6443624 均与 BC 风险性相关;FGFR-2 rs1219648和PI3KCA rs6443624的单核苷酸多态性可能有助于BC高危患者的鉴别,并可能是中国人群BC的潜在预后因素。(2)miR-494过表达能够抑制MDA-MB-453和MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡;miR-494沉默能够提高MDA-MB-453和MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭,对细胞凋亡影响不明显。(3)miR-494能够抑制FGFR-2表达,FGFR-2是miR-494的一个靶基因。(4)miR-494过表达通过调控FGFR-2抑制BC细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡。(5)miR-494能够通过调控FGFR-2的表达抑制RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路。