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目的和意义个体化治疗的发展使儿童急性白血病(Acute leukemia, AL)的疗效大大提高。药物代谢和肿瘤细胞的关系密切。研究提示柔红霉素(Daunorubicin,DNR)能够诱导白血病细胞系凋亡,同时有活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS )水平的改变。本课题主要研究儿童急性淋巴细胞白血病(Acute lymphocyte leukemia, ALL)个体之间的ROS水平与DNR细胞毒作用的关系,为个体化治疗提供一定的实验依据。方法用淋巴细胞分离液分离出AL细胞,用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测细胞的固有ROS、DNR(50、100、500ng/ml)、大黄素(Emodin,E)10uM/L和联合用药(E10uM/L +DNR50ng/ml)诱导24小时后的ROS水平,每次以U937细胞的ROS值作对照;诱导48小时后,用四甲基偶氮唑盐(Methyl-thiazol-tetrazolium,MTT)法检测以上各组及DNR100ng/ml和N-乙酰-L-半胱氨酸(Nacetylcysteine, NAC)10mM/L联合用药后的细胞相对活力;运用FCM和hoechst33342-PI染色法观察凋亡现象。结果1、11例儿童ALL细胞的固有ROS水平与DNR的IC50呈负相关(P<0.05)。在14例儿童AL中(其中11例ALL,3例急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)),细胞的固有ROS水平与DNR IC50也呈负相关(P<0.05)。2、11例ALL细胞的固有ROS水平之间有差异(p<0.05)。以U937细胞的ROS值为对照,其固有ROS水平为0.2602±0.1178,11例经50ng/ml、9例经100ng/ml、7例经500ng/ml的DNR诱导24小时后,ROS分别为0.2908±0.1315,0.2849±0.1254和0.2565±0.0987。DNR50、100ng/ml时ROS上升(p<0.05),而DNR500ng/ml时与固有ROS水平无差别,但较DNR100ng/ml时有下降(p<0.05)。在15例AL细胞中(11例ALL,4例AML),经DNR50、100ng/ml诱导后ROS水平也上升,至DNR500ng/ml时开始下降(p<0.05)。3、11例ALL细胞经DNR(50、100、500ng/ml)诱导48小时后细胞相对活力随着浓度的升高而下降,分别为75.45±18.02%,53.85±18.76%和41.54±21.23%(p<0.05)。14例AL细胞(11例ALL,3例AML)经以上浓度诱导后,细胞活力亦逐渐下降(p<0.05)。4、在5例AL细胞中,经NAC10mM/L与DNR100ng/ml联合用药48小时后,细胞相对活力显著升高(p<0.05),从单用DNR100ng/ml的56.33±17.46%上升到104.63±22.19%。5、DNR诱导ALL细胞后,FCM和hoechst33342-PI染色均检测到凋亡和坏死,并随着浓度的增加凋亡增多。6、以U937细胞的ROS值为对照,10例ALL细胞的固有ROS水平为0.2587±0.1294,经DNR50ng/ml、E10uM/L和DNR50ng/ml+E10uM/L联合用药24小时后ROS分别为0.2941±0.1447,0.3159±0.1522和0.3421±0.1706,均能增加细胞内ROS水平(p<0.05),且联合用药比DNR单用具有更高的ROS水平(p<0.05)。12例AL细胞(10例ALL,2例AML)中,以上各组亦能增加细胞内ROS水平(p<0.05)但联合用药与DNR单用的ROS水平无明显差异(p>0.05)。7、11例ALL细胞经E10uM/L诱导48小时后,细胞相对活力为102.17±14.45%,无明显的细胞毒性(P>0.05),联合用药组比DNR组具有更强的细胞抑制率,细胞活力从75.45±18.01%下降到58.22±19.16%( p<0.05);两药相互作用指数(Combination index,CI)<1,具有协同作用( p<0.05),且能达到DNR100ng/ml的抑制效果(P>0.05)。在14例AL中(11例ALL,3例AML),得出的结果同ALL。8、11例ALL中耐药组( IC50> 225.77ng/ml )和敏感组(IC50<225.77ng/ml)的固有ROS水平分别为0.1811±0.0765和0.3065±0.0594,两者有显著性差异(p<0.01)。DNR50ng/ml联用E10uM/L后,耐药组细胞活力由88.82±11.68%下降到73.18±13.12% ,有统计学差异(P<0.05),而敏感组细胞抑制率无明显上升(P>0.05)。在14例AL中(11例ALL,3例AML),结果同ALL。9、ALL细胞经DNR合用E后,形态学上观察到凋亡现象增强。10、与临床危险度分析得出:在19例ALL患儿中,高危组的固有ROS水平低于低危组(P<0.05)。固有ROS水平与性别、年龄、免疫分型、初发时外周血白细胞数、药物影响、泼尼松反应和第19天骨髓幼稚数无关;儿童初发ALL细胞的固有ROS水平(0.2801±0.1206)低于AML(0.4197±0.1374),有统计学差异(P<0.05)。结论1、ALL和AL细胞固有ROS水平与DNR的细胞毒性正相关。2、ALL个体固有ROS水平之间有差异。DNR诱导ALL和AL细胞后ROS水平升高,ROS参与DNR的细胞毒作用。DNR的细胞毒作用呈浓度依赖。3、E能提高ALL和AL细胞的ROS水平,并增加DNR的细胞毒性。两者有协同性。4、E能逆转DNR-耐药的ALL和AL细胞的耐药性,而对DNR敏感细胞的增敏作用不强。5、DNR对ALL细胞的细胞毒作用中包含凋亡。6、ALL细胞固有ROS水平越高,危险度分级越大。AML细胞的固有ROS水平高于ALL。