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本研究以我国常见的鲤鱼(Cyprinus carpio L.)为材料,对鲤鱼脾脏组织细胞膜表面存在的免疫球蛋白结合蛋白(IGBP)进行了分离,并对其在鲤鱼其它组织中的分布进了研究。
1.采用Hitrap protein A HP亲和层析法从鲤鱼血清中纯化得到IgM,SDS-PAGE分析表明,血清IgM可以解离形成重链和轻链,分子量分别为82kDa和29kDa。
2.以鲤IgM制备亲和层析柱,制备收集鲤鱼脾脏细胞膜蛋白并经IgM制备的亲和层析柱,分离纯化获得鲤鱼IgM结合蛋白(IGBP),SDS-PAGE分析表明,在38 kDa到45 kDa范围内共有三种IgM结合蛋白。用IgM结合蛋白作为抗原免疫豚鼠制备豚鼠抗IGBP的抗血清。
3.利用不同的荧光标记物对鲤鱼脾脏、肠、皮肤及肝组织细胞进行免疫荧光标记,并进行激光共聚焦观察分析。首先,利用FITC标记鲤鱼血清IgM(简称FITC-IgM),进行免疫组织化学研究发现,鲤鱼脾脏、肠、皮肤及肝组织细胞呈现IgM结合阳性。进一步利用亲和层析分离得到的IGBP免疫豚鼠制备抗IGBP抗血清(Anti-IGBP)作为一抗,以FITC标记的羊抗豚鼠抗体为二抗进行间接免疫荧光染色。观察显示,鲤鱼脾脏、肠、皮肤及肝组织细胞呈现IGBP阳性,而以正常豚鼠血清作为一抗的对照组则显示IGBP阴性。以上研究结果表明,IgM结合蛋白(IGBP)不仅存在于脾脏组织细胞中,同时鲤鱼肠、皮肤及肝组织的细胞也有IgM结合蛋白(IGBP)的存在。
本研究通过亲和层析方法获得鲤鱼脾脏细胞膜IgM结合蛋白(IGBP),在鱼类粘液性免疫球蛋白转运及免疫反应中都需要IgM结合蛋白(IGBP)的参与,因而IgM结合蛋白(IGBP)在鱼类特异性体液免疫中可能起到关键作用,对其进行深入研究对全面了解鱼类以IgM为中心的特异性免疫具有重要意义。