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脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)往往造成严重的后果,患者往往伴随终身的功能障碍,为社会及家庭地带来沉重的负担。因此,促进脊髓损伤后的神经修复,提高功能恢复水平,显得迫切且必要。细胞移植对于脊髓损伤后的功能恢复具有显著的作用。雪旺细胞(Schwann cell,SC)是外周神经系统(Peripheral nerve injury,PNI)的成髓鞘细胞,对于神经的再生与修复具有明确且显著的作用;雪旺细胞能够分泌多种促进并维持神经轴突生长的神经营养因子以及对再生轴突具有引导作用的支持基质,同时,雪旺细胞还能够再髓鞘包裹、保护再生的神经轴突以及脱髓鞘的神经轴突,为再生的神经轴突“搭桥铺路”,引导其延伸进入脊髓损伤远端,进而促进功能的恢复;因此,雪旺细胞是最具有临床应用前景的治疗脊髓损伤的种子细胞之一。雪旺细胞移植治疗脊髓损伤仍然还有很多局限性限制了疗效的进一步提高。雪旺细胞移植到中枢神经系统(Central nervous system,CNS)后,细胞的迁移能力受到极大限制,宿主星形胶质细胞包裹雪旺细胞,二者形成明显的细胞边界,无法实现引导再生神经轴突的修复作用,与星形胶质细胞形成的边界也阻碍了再生轴突的长入。采用基因修饰的办法将多聚唾液酸转移酶(Polysialyltransferase,PST)转染进入雪旺细胞,诱导细胞过表达唾液酸化的神经细胞粘附分子(Polysialylation of neural cell adhesion molecule,PSA-NCAM),提高细胞的迁移能力,动物实验证实脊髓损伤部位再生轴突增多,功能恢复水平提高。因此,我们设想,利用SPIONs将PST磁转染进入雪旺细胞,一方面,PST表达上调可增强雪旺细胞的迁移能力,另一方面,通过施加外部磁场对细胞施加定向牵引力,引导雪旺细胞的定向迁移。通过上述策略,增强雪旺细胞的定向迁移能力,以提高雪旺细胞移植治疗脊髓损伤的疗效。第一部分:磁性纳米微粒的物理特性及其对雪旺细胞生物活性的影响目的:明确磁性纳米微粒的物理形态及表面电势,入胞后在细胞内的分布形态;明确PEI-SPIONs磁转染雪旺细胞的细胞毒性,筛选最佳转染浓度。方法:利用透射电子显微镜测量PEI-SPIONs的粒径并观察其分布形态,利用Zeta电势/粒径测量仪分布测量PEI-SPIONs及PEI-SPIONs/PST复合物的粒径及表面电势;利用CCK-8试剂盒及细胞活-死染色试剂盒明确不同浓度PEI-SPIONs磁转染雪旺细胞后的细胞活性及死亡细胞比率。结果:透射电子显微镜发现:PEI-SPIONs的平均粒径为28.2?3.6nm,PEI-SPIONs的磁饱和度在3.382Oe时为61.62emu/g,Zeta电势/粒径测量仪测得PEI-SPIONs粒径为186.5?23.4nm,表面电势为19.20?3.2mV;测得PEI-SPIONs/PST复合物的平均粒径为378.8?109.1nm,表面电势为17.51?2.4mV。磁转染24h后,PEI-SPIONs磁转染浓度低于4μg/μL时,死细胞的比例为3.01%-5.26%,当磁转染后72h时,死亡细胞比例与磁转染后24h相比无统计学差异;磁转染浓度为8μg/μL时,转染24h及72h后死亡细胞比例分别增加至6.41%±1.03%和6.63%±1.16%;CCK-8试剂盒分析细胞活性,磁转染后24h及72h,转染浓度0μg/μL,1μg/μL,2μg/μL,4μg/μL之间,细胞活性无统计学差异,当转染浓度提高至8μg/μL时,磁转染后24h及72h细胞活性分别下降19.23%和22.41%。结论:PEI-SPIONs及PEI-SPIONs/PST复合物的阳性表面电势更适于细胞吞入;在磁转染PEI-SPIONs浓度(27)8μg/μL时,对细胞的毒性较小;透射电子显微镜及Zeta电势/粒径测量仪所测得的粒径差异可能归因于Zeta电势/粒径测量仪标本时,表面带电荷的PEI-SPIONs发生的聚集现象。第二部分:PST磁性纳米微粒转染雪旺细胞对PSA-NCAM表达的影响目的:确定PEI-SPIONs/PST磁转染雪旺细胞对细胞内PSA-NCAM表达的影响。方法:利用扫描电子显微镜观察磁转染后雪旺细胞形态以及PEI-SPIONs贴附至细胞膜的形态及分布,利用透射电子显微镜观察磁转染后PEI-SPIONs在雪旺细胞细胞内的分布形态;利用PCR测定不同PEI-SPIONs转染浓度及不同质量比PEI-SPIONs/PST磁转染细胞后对PST mRNA水平的影响,Western blot检测磁转染后雪旺细胞内PSA-NCAM的蛋白表达水平,利用免疫荧光染色特异性标记PSA-NCAM,观察PEI-SPIONs/PST磁转染雪旺细胞后PSA-NCAM的表达水平。结果:磁转染6h后,扫描电子显微镜可以观察到细胞膜上有颗粒状物,而在未转染的细胞膜上没有观察到;磁转染后24h,在雪旺细胞之内能够观察到一簇颗粒状物,表明了PEI-SPIONs已经贴附到细胞膜上通过内吞作用转移到了细胞质内;PCR结果表明,随着PEI-SPIONs转染浓度从1μg/m L上升至4μg/mL,PST的mRNA水平也明显的增高;另外,随着PEI-SPIONs/PST的质量比从1:2提高至1:4,PST的mRNA水平在PEI-SPIONs浓度1μg/mL时上升了2.20倍,2μg/mL时上升了20.11倍,4μg/m L时上升了1.89倍。在PEI-SPIONs转染浓度4μg/m L,PEI-SPIONs/PST质量比1:4时,PST的mRNA水平是正常对照组的1041倍;Western blot结果显示,PEI-SPIONs/PST磁转染组的PSA-NCAM蛋白表达水平明显增高,但在对照组中仅仅检测到了很少的表达;PEI-SPIONs/PST磁转染组雪旺细胞特异性PSA-NCAM染色显示表达水平很高,而在对照组几乎没有PSA-NCAM特异性染色标记。结论:通过PCR检测PST的mRNA水平以及Western blot和免疫荧光染色测定细胞PSA-NCAM的表达水平,我们可以看出PST磁转染雪旺细胞在细胞内成功表达,并且诱导了细胞PSA-NCAM的高表达。首次成功使用磁转染技术成功转染雪旺细胞并诱导了PSA-NCAM的高表达。第三部分:外部磁场对PST磁转染后雪旺细胞迁移及定向能力的影响目的:探索外部磁场对磁转染后雪旺细胞在星形胶质细胞环境中的迁移及定向能力的影响。方法:利用雪旺细胞在星形胶质细胞层上的迁移实验测试雪旺细胞的迁移能力,测量迁出雪旺细胞的最大迁移距离,平均迁移距离,迁出细胞数量以及迁出雪旺细胞的定向指数;利用雪旺细胞与星形胶质细胞分区共培养实验,测试雪旺细胞能否穿越星形胶质细胞边界,进入星形胶质细胞区域,测量迁入星形胶质细胞区域的雪旺细胞数目以及迁入的平均距离。结果:当PST磁转染雪旺细胞时,在外部磁场作用下,细胞在星形胶质细胞层上的迁移能力被更进一步增强,并且细胞的迁移方向规律地沿着外部磁场的方向排列;PST磁转染雪旺细胞在有外部磁场时(56.8?9.72/500?m,p(27)0.05),在特定距离玻片边缘的迁出数量明显多于无磁场时(46.3?6.47/500?m,p(27)0.05)。在有外部磁场时,PEI-SPIONs/PST/SC以及PEI-SPIONs/DNA/SC实验组的雪旺细胞均能打破与星形胶质细胞的细胞边界并且沿着外部磁场方向规律排列;但PEI-SPIONs/PST/SC迁移进入星形胶质细胞区域的细胞数量是PEI-SPIONs/DNA/SC的1.85倍(p(27)0.05)。结论:PST磁转染后雪旺细胞使细胞在星形胶质细胞环境中的迁移能力增强,外部磁场与SPIONs的相互作用进一步增强了雪旺细胞的迁移能力,并且可控制细胞的迁移方向;因此,利用磁场的方向性,可以实现引导雪旺细胞在星形胶质细胞中定向迁移,进而为引导再生轴突延伸进入脊髓损伤远端打下基础。