肥胖是危害人类健康的潜在病因,且全球肥胖发生率在逐年增加。肥胖可引发多种并发症,例如代谢综合征、糖尿病、心血管疾病,特别是肥胖伴随的高血压可直接导致脑中风、心肌梗死。研究表明,多种病理机制参与肥胖相关高血压的发生与发展。例如,肥胖可改变中枢对心血管活动的调控,增强交感神经传出活动。此外,肥胖可直接引起外周血管收缩功能增强、外周阻力增加。两者共同作用引起动脉血压升高。饥饿素(orexin)是中枢下丘脑外侧核合成的兴奋性肽类物质,于1988年被两个实验室几乎同时发现并报道。Orexin分为两种:orexin A以及orexin B,可通过与两种G蛋白偶联受体-饥饿素受体1(orexin receptor1,OXR1)和饥饿素受体2(orexin receptor 2,OXR2)结合而发挥生物学效应。虽然饥饿素的合成仅在下丘脑外侧核团,但其神经纤维广泛投射于中枢神经系统,参与广泛的机体活动调节,例如饮食、睡眠、觉醒、应激等。众多研究发现,饥饿素及其受体对心血管活动的基础活动具有重要的维持作用,并且与高血压发生有关。在orexin基因敲除的小鼠,其外周动脉血压明显低于对照正常小鼠,提示orexin是维持正常心血管活动必不可少的因素。在血压正常的WKY大鼠,微量注射饥饿素于心血管调控中枢-延髓头端外侧区(rostral ventralateral medulla,RVLM)可引起外周动脉血压升高;相反,在自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats,SHR),RVLM微量注射饥饿素受体阻断剂可显著降低外周动脉血压。电生理学研究显示,给予orexin可引起RVLM、孤束核(NTS)、及下丘脑外侧核神经元去极化,导致神经元自发放电频率增加。进一步研究表明,orexin对中枢神经元的兴奋作用与L型Ca2+通道活动增强、兴奋性突触前电流以及非选择性突触后阳离子电流(non-selective canton current,NSCC)增强有关。总之,orexin及其受体对心血管中枢具有重要的调节作用,其功能增强可能是导致动脉血压升高的重要病理生理学机制之一。下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)是连接机体神经-内分泌调节的重要核团,参与机体饮食、睡眠、能量代谢等多种生理功能的调节。神经解剖学显示,下丘脑PVN神经元可直接投射到多个心血管中枢部位,例如RVLM和NTS。尤其值得关注的是,PVN神经元可直接投射到胸段脊髓中间外侧柱,通过脊髓交感节前神经元直接参与对交感神经系统的调节。在体动物研究结果显示,PVN注射中枢兴奋性递质谷氨酸受体(NMDA受体)阻断剂可显著降低自发性高血压大鼠肾交感神经传出活动,引起血压下降;同样,给予PVN抑制性递质GABA受体激动剂亦引起血压降低并伴有交感活动降低;结果提示PVN在中枢血压调控中发挥重要作用。肥胖Zucker大鼠(obesity Zucker rats,OZRs)由于瘦素受体突变导致其功能缺失,从而进食增加,导致肥胖。大量研究表明,成年OZRs较正常Zucker大鼠(lean Zucker rats,LZRs)血压升高,外周交感活动增强。OZRs已作为肥胖性高血压模型应用于高血压机制的研究。因此,本研究采用肥胖Zucker大鼠探讨下丘脑PVN饥饿素及其受体在肥胖相关高血压中的作用及其中枢机制。第一部分:下丘脑室旁核饥饿素及其受体对肥胖Zucker大鼠动脉血压的调节作用目的:观察下丘脑PVN饥饿素受体在肥胖Zucker大鼠动脉血压调控中的作用。方法:成年OZRs以及LZRs在麻醉状态下,机械通气维持呼吸,股动脉插管检测动脉血压;通过记录左侧肾交感神经放电(renal sympathetic nerve activity,RSNA)反映交感神经系统活动;PVN微量注射orexin A、OXR1以及OXR2选择型受体阻断剂,观察对动物血压以及RSNA的影响。通过western blot检测PVN中两种orexin受体变化。为排除体重对动脉血压的影响,采用tail cuff方法观察6周龄清醒大鼠收缩压,以及采用western blot测定PVN中两种受体的变化。结果:基础状态下,OZRs平均动脉压(mean blood pressure,MAP)以及心率(heart rate,HR)显著高于LZRs;PVN微注射OXR1选择性阻断剂SB334867可显著降低OZRs的MAP、HR以及RSNA,但不能降低LZRs的MAP、HR和RSNA。而OXR2选择性阻断剂对LZRs和OZRs的血流动力学以及RSNA均无影响。以上结果提示,PVN中OXR1而非OXR2在OZRs大鼠血压调控中发挥作用。进一步研究显示,PVN微量注射orexin A可剂量依赖性地增加两组大鼠的动脉血压、心率及RSNA,但orexin A对OZRs的升压效应显著高于LZRs,提示OZRs PVN中OXR1功能增强。Western blot检测结果显示,OZRs PVN中OXR1表达较LZRs显著升高,而OXR2表达在两组大鼠之间无显著差异。为排除体重肥胖对血压的影响,我们检测了6周LZRs和OZRs的动脉血压以及PVN中两种orexin受体的变化,结果显示,虽然5周OZRs体重较LZRs显著增加,但两组动物之间收缩压以及两种orexin受体均无显著差异,提示OZRs高血压与其肥胖无关。小结:肥胖Zucker大鼠由于PVN中OXR1表达上调,导致外周交感传出活动增强,心率加快,引起动脉血压升高。第二部分:饥饿素1型受体对肥胖Zucker大鼠下丘脑室旁核交感前神经元兴奋性的调节作用目的:探讨饥饿素受体对下丘脑PVN交感前神经元兴奋性的影响及其机制。方法:成年OZRs以及LZRs在麻醉状态下,机械通气维持呼吸,股动脉插管检测动脉血压;脊髓胸段T3-T4中间外侧柱微量注射红色荧光染料逆行追踪标记下丘脑PVN交感前神经元;全细胞电流钳用于记录交感前神经元的自发放电频率(renal sympathetic nerve activity,RSNA)以及膜电位(membrane potential,MP);全细胞电压钳记录最小突触前兴奋性膜电流(miniature excitatory presynaptic currents,m EPSC)以及非选择性阳离子电流(non-selective cation currents,NSCC);应用免疫荧光技术确定交感前神经元orexin受体表达,进一步明确orexin A对PVN交感前神经元的作用是通过orexin受体所发挥。结果:基础状态下,OZRs PVN中交感前神经元MP及其RF均显著高于LZRs。鉴于第一部分在体实验提示在OZRs大鼠PVN中OXR1介导的升压效应显著大于LZRs,首先给予OXR1选择性阻断剂SB334867,观察交感前神经元MP和RF的变化。结果显示,阻断OXR1对LZRs大鼠交感前神经元MP和RF无影响,提示其兴奋性无显著改变。而在OZRs大鼠,交感前神经元MP和RF显著下降,提示其兴奋性降低。然而给予OXR2选择性阻断剂TCS209对两组大鼠交感前神经元MP和RF均无显著影响,提示OXR2与大鼠PVN交感前神经元兴奋性无关。为进一步明确上述阻断剂是通过阻断orexin受体发挥作用,给予orexin A,观察PVN交感前神经元MP和RF的变化。结果显示,orexin A可剂量依赖性地兴奋两组大鼠PVN交感前神经元,增强MP和RF。orexin A对OZRs的兴奋性增强效应显著高于LZRs。orexin A介导的PVN交感前神经元兴奋性增强效应可被SB334867预处理所阻断,而TCS209预处理对此兴奋性增强效应无影响。此外,形态学结果显示,PVN中逆行标记的交感前神经元95%以上显示为OXR1阳性,并且两组大鼠之间无显著差异。为明确orexin A的兴奋作用是通过突触前或突触后所实现,在全细胞电压钳实验中给予TTX处理。结果显示,两组大鼠PVN交感前神经元m EPSC无显著差异,并且orexin A对两组交感前神经元m EPSC无显著影响,提示orexin A对交感前神经元兴奋作用与突触前兴奋性电流变化无关。而orexin A对大鼠PVN交感前神经元NSCC影响结果显示,orexin A可显著增大两组大鼠PVN交感前神经元NSCC,经电流电压拟合后,NSCC呈现非电压依赖性,并且NSCC的增强在OZRs显著大于LZRs。结果表明,orexin A增强OZRs PVN交感前神经元的兴奋作用,主要与增强突触后NSCC有关。小结:orexin A可通过激活OXR1而非OXR2,显著增强OZRs PVN交感前神经元兴奋性,此作用与orexin A增强突触后非选择性阳离子电流有关。第三部分:下调室旁核饥饿素1型受体对肥胖Zucker大鼠高血压的改善作用目的:观察下调下丘脑PVN饥饿素受体1对肥胖Zucker大鼠动脉血压的影响及其机制。方法:成年肥胖Zucker大鼠随机分为三组:OZRs、OXR1-SHR、OXR1-SCR,其中OXR1-SHR接受PVNOXR1-sh RNA微量注射,OXR1-SCR接受PVNnon-functional RNA微量注射。采用干扰RNA技术降低下丘脑PVN中OXR1表达,并同时采用无线遥测植入技术连续动态监测动物42天OXR1下调过程中动脉血压的变化。采用Labchart软件提取脉搏间期,进而分析心率变异度(heart rate variability,HRV),包括极低频VLF、低频LF以及高频HF,LF/HF用于反应交感神经活性的变化;应用western blot比较OXR1蛋白表达变化以明确OXR1下调;在体PVN分别给予orexin以及OXR1受体阻断剂,观察MAP、HR以及RSNA的变化;应用全细胞电流钳方法观察OXR1下调对PVN交感前神经元兴奋性的影响。结果:基础状态下三组大鼠的MAP和HR相互之间无显著差异。PVN注射OXR1-sh RNA1后23天,OXR1-SHR组大鼠MAP开始逐渐下降,到第26天其MAP显著低于OZRs以及OXR1-SCR组大鼠。心率变异度分析发现,虽然三组大鼠之间总频谱能量没有差异,但OXR1-SHR组大鼠LF/HF比值显著低于其余两组大鼠。同时,42天后,OXR1-SHR组大鼠PVN中OXR1受体含量显著低于其余两组大鼠,而后两组动物之间无显著差异。整体功能学研究结果显示,PVN给予OXR1受体选择性阻断剂SB334867可显著降低OZRs以及OXR1-SCR组大鼠MAP、HR和RSNA,但是对OXR1-SHR组大鼠血流动力学无显著影响;同时OXR1-SHR组大鼠对PVN注射orexin A引起的升压效应显著低于OZRs和OXR1-SCR组大鼠。全细胞电流钳研究结果显示,OXR1-SHR组大鼠PVN逆行标记的交感前神经元放电频率显著低于其余两组大鼠,并且orexin A引起的兴奋效应明显减弱。综上所述,OXR1-sh RNA可显著降低OZRs大鼠PVN中OXR1表达,降低其兴奋性,改善交感活性增强,降低动脉血压。小结:降低肥胖Zucker大鼠PVN中OXR1表达可通过抑制PVN交感前神经元兴奋性、降低外周交感神经活性,进而改善肥胖Zucker大鼠高血压。结论:OZRs下丘脑PVN中OXR1受体表达上调通过增强突触后非选择性阳离子通道电流,提高下丘脑PVN交感前神经元兴奋性,使外周交感神经传出活动增多,导致心率加快、血压升高;相反,通过OXR1-sh RNA下调OZRs下丘脑PVN中OXR1表达可显著降低交感前神经元兴奋性,进而引起外周交感传出活动降低,导致心率减慢、血压降低。