背景目前,冠心病成为全球范围内影响人类寿命的重大问题,国内外专家对冠心病的关注程度日益增加。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病发生的病理基础,也是一种复杂的多因素疾病。有研究表明，遗传因素贯穿于动脉粥样硬化的始终。基因的变化可能在AS斑块的进展和/或失稳中起重要作用。遗传流行病学研究也显示遗传因素在冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生、发展中有重要意义。近年来随着分子生物学技术的迅速发展，从基因方面阐明冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生将为冠状动脉粥样硬化性心脏病的诊治开辟一个新领域。既往我们的研究表明Connexin37C1019T基因多态性与冠心病存在明显相关性，而且在男性人群中这种关联性更强，同时在其他部位动脉粥样硬化性疾病的研究中也提示存在相关性。但是，究竟是哪种等位基因与冠心病相关目前存在争议，这可能与样本量大小、地区差异、临床事件终点的选择（冠心病还是心肌梗死）等相关，Connexin37基因多态性与冠心病的确切关系还有待大规模的病例对照研究、前瞻性研究加以证实。在发病机制方面，目前已明确的是：在早期动脉粥样硬化斑块形成阶段，Connexin37基因多态性主要通过调节单核细胞黏附性来促进斑块形成，但在斑块进展期及斑块破裂继发血栓形成阶段，Connexin37基因多态性具体分子作用还有待进一步阐明。基因沉默技术，又称RNA干扰(RNAinterference, RNAi)技术，可以高效特异地阻断目标基因的表达，目前已经广泛地应用于体内和体外基因功能的研究中。哺乳动物细胞实验发现，化学合成的核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs,siRNAs)，或是质粒或病毒载体介导的siRNA，均可引发基因沉默或者表达抑制。RNA干扰技术在细胞水平致病基因的功能研究中得到广泛应用。借助于质粒或病毒载体的介导，siRNA已经被用于体内实验，特异性降低靶基因的表达。在进一步完善siRNA稳定性的基础上，RNAi的试剂有望应用于临床研究。综合国内外的研究现状，Cx37在AS中的作用的研究才刚刚开始，Cx37在AS发展中可能起到了重要的作用，我们设想应用基因沉默技术干扰高脂饮食猪腹主动脉动脉斑块Cx37表达，可能有助于阻止AS进程，综上所述，本研究分为三部分：第一部分研究目的：构建携带Cx37siRNA慢病毒表达载体：根据Cx37基因设计siRNA相应的DNA片段，分子克隆到BLOCK．It Lemiviral Pol II miRNAi表达载体，并验证Cx37i体内体外的基因沉默效应；选择沉默最佳Cx37siRNA。转染HEK293细胞培养，通过同源重组，生成携带有Cx37siRNA的病毒悬液。第二部分研究目的：通过高脂饮食建立猪动脉粥样硬化模型。第三部分研究目的：血管内超声检测猪腹主动脉粥样硬化斑块，测量斑块的体积斑块性质后，局部定位注射Cx37siRNA病毒悬液，两月后观察Cx37siRNA对AS进程的影响。1.材料与方法1.1细胞培养HEK细胞系用先前报道的培养方法。所有细胞培养基都购自美国Gibco-BRL公司，HEK293细胞来自中国科学院的细胞库。脂质体2000转染试剂购自美国Invitrogen公司。3条野生型Cx37干扰片段、阴性对照组和P3xflag-Cx37都是用RNA干扰技术转染质粒，与脂质体2000按摩尔比率5:1混合。1.2慢病毒载体的制备与筛选RNA干扰靶点首先，据基因库中猪Cx37基因中设定3条RNA干扰的靶序列（分别为A, B, C），靶序列mm-Cx37-1:5GGUUAACGGUGCUCUUCAU3定位：209，靶序列mm-Cx37-si-2:5CCAAGGACCUACAUGUAGA3定位：488，靶序列mm-Cx37-si-3:5`CAGACCCUUACCCUGAACA3定位：841。P3xflag-Cx37和P3xflag作为对照组。第二步，将3条RNA干扰序列和对照组序列通过脂质体转染HEK293细胞，72小时后收集细胞，用冷磷酸盐缓冲液洗涤三次，吸取PBS残留液体，加入含有蛋白酶抑制剂0.2ml的放射免疫溶菌缓冲剂，在冰上放置30分钟，用细胞刮棒从离心管在冰上分离出细胞1.5ml，4℃下超声溶解细胞30s，12000转/分钟离心30分钟后取上清液移至另一个干净的微型离心管，置-20℃冰箱储存。第三步，用BCA测定蛋白浓聚物：使用96孔BCA蛋白含量测定试剂盒。A液与B液50:1混合，在室温下放置30分钟后每孔加入200μL，加入标准样品牛血清白蛋白和10μL蛋白样品（1:10稀释度），空白孔加入双蒸馏水10uL调节至0，在37℃酶标仪器里放置30分钟后测定570nm吸光率，标准样品作为标准曲线，计算所有蛋白样品的浓聚度。第四步，用Western blot法检测siRNA干扰的有效性：10%SDS-PAGE聚合物，每个样品均量30ug；抗体标志，4℃过夜孵化；GAPDH监测样本的表达量。标志抗体：家兔，1:2000；GAPDH:家兔，1:10000抗体。所有细胞分为六组：实验组：过表达空质粒组，Cx37质粒，过表达Cx37重组质粒，不同干扰片段。转染试剂：脂质体2000转染试剂；质粒：P3xflag, P3xflag-Cx37-0.4ug；干扰片段：50nM。转染时间：72小时，根据Western blot结果筛选出最佳干扰片段。表达Cx37的慢病毒BLOCK制备—RNA干扰绿色荧光蛋白表达系统（GFP）(产品编号：K4948-00；Invitrogen)。将目前认为与哺乳动物基因无同源性的乱序siRNA(称为mock-siRNA)作为对照组。根据基因沉默分析结果，选择siRNACx37B, C片段进行体外试验研究，以小鼠单核巨噬细胞系RAW263.7为靶细胞将mock-LV、Cx372i, Cx373i的慢病毒载体转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞。病毒转染五天后收集细胞进，荧光定量RT-PCR、Westernblot分别检测各转染细胞Cx37mRNA水平、蛋白质水平的表达，进一步筛选出有效阻断Cx37表达的小分子干扰RNA载体。1.3猪腹主动脉粥样硬化模型建立实验共60只雄性家猪，均同批次购自中国五指山，正常饮食，自由饮水。一周后接受高脂饮食（5%猪油，1%糖，3%胆固醇，0.2%丙硫氧嘧啶），一日三餐，持续十个月。1.4猪腹主动脉血管造影和血管内超声（IVUS）分析第8个月末，所有猪在麻醉后行腹主动脉血管造影和血管内超声检查。所有IVUS图像均由20-MHz Volcano Eagle Eye IVUS导管（Volcano Therapeutics Inc,. RanchoCordova, CA, USA）采集。辨别腹主动脉粥样硬化斑块后，IVUS导管通过该区域远端后以0.5毫米/秒的速度自动回撤。回撤全程在X线透视下监测IVUS导管位置，利用IVUS成像记录斑块位置。为了获得高质量的图片，在持续的心电监护下每个动脉平均会撤两次，根据图片的分辨率和质量选择最好的一个循环图像。IVUS虚拟组织学数据记录在硬盘，存档后用于分析，分析以灰阶图为基础。每个独立图片的组织图分析由软件提供支持（深绿色表示纤维组织，浅绿色代表纤维脂肪组织，红色表示坏死的内核，白色代表钙化）。在检测的全长血管中选择20mm血管片段平均分为10段2mm长的小片段用于分析。在此之后，打开腹腔、左结肠旁沟和小网膜，从腹主动脉上游离降结肠及其系膜至右侧，通过定位，短暂阻断上游血流，切开主动脉斑块，定位，30°方向进针，随机注射Cx37siRNA病毒悬液、mock-siRNA病毒悬液或生理盐水。然后缝合血管及腹腔。所有猪均接受高脂饮食，Cx37siRNA组，注射10μLCx37慢病毒悬液。非治疗组猪随机分为mock-siRNA和盐水亚组。Mock-siRNA注射10μLmock-siRNA，对照组注射不含病毒的生理盐水。两月后，所有猪接受腹主动脉造影和IVUS，分别用RT-PCR技术半定量测得Cx37mRNA表达，Western-blot检测Cx37蛋白表达量。所有用于本研究的动物均按照国际卫生组织指南规范使用。1.5血脂水平及体重测定在抽取眼静脉窦血液，由无锡市人民医院中心实验室用氧化酶法测定血脂水平，包括总胆固醇（TC），甘油三脂（TG），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），测定时间分别为高脂饮食喂养前，喂养8个月（注入siRNA前），喂养10个月（实验结束）。同时间点测定体重。2.数据分析计量资料采用均值±标准差。两组间连续变量采用独立t检验或方差分析。多组间变量比较采用ANOVA。所有检验采用SPSS17.0统计软件（北京雷安科技有限公司）。率及构成比比较采用卡方检验，当预期频率小于5时采用Fisher精确检验。P <0.05被认为有统计学意义。3.结果3.1三组不同时间体重，血脂水平及肝肾功能Cx37siRNA组与非治疗组（mock-siRNA亚组，生理盐水亚组）猪的体重无差异，说明病毒转染不影响猪的生长。同样的，血清胆固醇和甘油三脂水平也无差异，提示基因转染的疗效是独立于血脂水平独立存在的。另外，肝肾在组内、组间均无差异，提示SiRNACx37病毒转染对猪肝肾功能无明显影响。3.2体外基因沉默：用Western blot法检测Cx37沉默效果最佳的位点。HEK293细胞株通过慢病毒转染---基于载体表达的三种不同Cx37siRNA1、2、3，基因沉默分析显示，siRNA Cx372、3片段是沉默效果最好的干扰片段。根据结果，我们选择siRNACx372，3片段进行体外试验研究。体外实验结果显示：结果表明siRNA372，3片段基因Cx37mRNA水平的沉默效果分别是52%，50%，蛋白水平的抑制效果分别是83％，81％。据此，我们选择siRNACx373片段进行体内试验研究。3.3猪腹主动脉粥样硬化斑块内有效的慢病毒转染预实验局部病毒悬液注射腹主动脉粥样硬化证实了转染的有效性。用绿色荧光蛋白（GFP）表达水平是用于检测慢病毒转染有效性。在腹主动脉粥样硬化转染一周后检测到GFP荧光，表明转染了siRNA，两周后荧光增强，当实验结束时，即转染两月后，GFP荧光即使微弱但仍可见。这些结果提示腹主动脉粥样硬化斑块转染携带siRNA慢病毒的有效性。病毒的局部转染不改变体重（34.89+4.16kg Cx37siRNA转染组vs.34.54+3.87kg mock-siRNA亚组vs.31.96±4.84kg生理盐水亚组）。3.4体内基因沉默用实时PCR和Western-blot分析转染siRNA慢病毒后腹主动脉粥样硬化Cx37表达的水平。为评价体内慢病毒介导的基因沉默有效性，本实验检测猪腹主动脉粥样硬化的Cx37mRNA和蛋白表达水平。 Cx37mRNA水平在Cx37siRNA组下降到34%，mock-siRNA组下降到61%，生理盐水组下降到94%(P<0.05)，其中Cx37siRNA组显著下降。Western blot分析显示Cx37蛋白表达水平在Cx37siRNA干扰组较其他组低（0.21±0.07vs.0.65±0.06vs.0.54±0.07）。由此可见，斑块内应用siRNACx37慢病毒悬液能有效沉默Cx37。3.5IVUS检测Cx37siRNA在动脉粥样硬化斑块中的作用10月时（注射Cx37siRNA后两月）斑块坏死核心占比率较8月时（注射Cx37siRNA前）降低（5.26±2.11vs.7.83±1.03%, P <0.05）。mock-siRNA和生理盐水组斑块的坏死率在8月与10月间无差异（P=0.074, P=0.061）。Cx37siRNA组斑块体积较8月时减小（21.03±6.24vs.31.23±10.23，P <0.01）。相反，mock-siRNA和生理盐水组，斑块体积较8月时增大（38.54±13.56vs.32.12±11.21mm3,37.36±14.21vs.30.21±12.02mm3,P=0.031, P=0.027）。结论：1．本研究成功地应用RNA干扰技术构建了针对猪Cx37基因的慢病毒干扰载体。2．本研究利用高脂饮食成功建立猪动脉粥样硬化模型。3．体内实验结果表明，Cx37基因沉默能有效的抑制斑块局部Cx37基因的表达，成功应用血管内超声虚拟组织学技术成功评估了siRNA沉默Cx37促进斑块稳定及缩小斑块。