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第一部分TRPC1&4在大鼠蛛网膜下腔出血模型脑组织中的表达及其对神经元影响的研究目的:已有研究表明瞬时电位受体钙离子通道1和4(TRPC1&4)参与到大鼠蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后血管痉挛的发生发展中,但TRPC1&4在SAH后早期脑损伤(early brain injury,EBI)中的作用尚未见报道。本课题拟利用体内外SAH模型研究TRPC1&4的表达及其对神经元的影响。方法:体内实验:通过将0.3ml非肝素化动脉血注入大鼠视交叉前池,建立实验性SAH模型。第一部分,取25只成年雄性SD大鼠,随机分为两个组:假手术组和SAH组,SAH组又分为1d,2d,3d,5d,7d组。分别在SAH建模后1d,2d,3d,5d,7d处死大鼠并取出脑组织,利用western blot检测TRPC1&4的蛋白表达的动态变化。第二部分,取55只成年雄性SD大鼠,随机分为四个组:假手术组和SAH组,SAH+溶剂(DMSO)对照组和SAH+TRPC拮抗剂(溶解于DMSO的SFK96365)治疗组。其中SAH+TRPC拮抗剂(溶解于DMSO的SFK96365)治疗组和SAH+溶剂(DMSO)对照组,在大鼠SAH模型建立前的半小时、模型建立后每天上午8点,分别接受SFK96365溶液(以1.0mg/公斤体重的剂量)和等量的溶剂DMSO的腹腔注射。SAH后72h处死大鼠并取脑组织,利用免疫荧光和western blot的方法验证TRPC拮抗剂的干预效果,利用TUNEL/NeuN共染与FLUORO-JADE B染色检测神经元凋亡和坏死情况,利用western blot的方法检测脑实质中白蛋白含量的变化来评价血脑屏障的损伤情况,利用干湿比法检测脑水肿程度。体外实验:利用氧合血红蛋白处理原代培养的神经元,建立体外SAH模型。细胞分为5组:正常组,氧合血红蛋白组,氧合血红蛋白+阴性对照组,氧合血红蛋白+TRPC siRNA组,氧合血红蛋白+TRPC overexpression组。提取神经元细胞总蛋白以western blot的方法检测TRPC上调及下调的干预效果,利用TUNEL与LDH试剂盒检测神经元凋亡和坏死情况。结果:1.SAH后一天TRPC1&4的表达持续升高,第五天达到高峰,SAH后7d基本恢复正常。2.与sham组相比,SAH后72h神经元凋亡率和坏死率显著增高(P<0.01),溶剂对照组与SAH组大鼠神经元神经元凋亡率和坏死率相比无统计学差异(P>0.05),而TRPC拮抗剂治疗组中神经元凋亡率和坏死率高于溶剂对照组(P<0.05)。3.SAH后72h脑组织内白蛋白含量显著增高(p<0.001),TRPC拮抗剂加剧其增高(p<0.001)。4.SAH后72h脑水含量升高(p<0.01),TRPC拮抗剂对SAH后脑水含量无显著影响。5.体外实验中氧合血红蛋白处理组神经元的凋亡率(p<0.001)和坏死率(p<0.001)较正常组显著升高;TRPC1&4下调后凋亡率(p<0.01)和坏死率(p<0.01)较氧合血红蛋白处理组更高,T RPC1&4上调后凋亡率(p<0.01)和坏死率(p<0.05)较氧合血红蛋白处理组低。结论:SAH后EBI过程中,TRPC的蛋白水平于72小时表达最高。SAH后神经元的凋亡率和坏死率均显著上升,TRPC1&4下调进一步加剧神经元的凋亡和坏死;反之,TRPC1&4上调可以显著缓解神经元的凋亡和坏死。说明在SAH后EBI过程中,TRPC1&4可能作为一种内源的神经保护因子发挥作用。第二部分TRPC1&4在大鼠蛛网膜下腔出血模型脑组织中作用机制的研究目的:N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)磷酸化后具有神经元毒性,有文献报道TRPC可以对NMDAR的磷酸化进行调控,而钙调磷酸酶(CN)也可以对NMDAR的磷酸化起到调控作用,CN与活化T细胞核因子(NFAT)的细胞定位密切相关。本课题拟利用CN拮抗剂(FK506)和激动剂(CHA)研究SAH后CN在TRPC1&4介导的神经保护作用,并探讨TRPC1&4与CN、NMDAR和NFAT之间的联系。方法:体内实验:任选90只成年雄性SD大鼠,随机分为以下六个实验组:正常组、SAH组、SAH+溶剂对照组、SAH+TRPC拮抗剂(SFK96365)治疗组、SAH+CN拮抗剂(FK506)治疗组和SAH+CN激动剂(CHA)治疗组。在TRPC拮抗剂/CN拮抗剂/CN激动剂治疗组,模型建立前的半小时、模型建立后每天,腹腔注射SFK96365/FK506/CHA溶液(按1.0mg每公斤体重剂量)。溶剂对照组以同样的方式接受等量DMSO腹腔注射。在造模后72小时处死实验大鼠,用FJB染色法测定神经元坏死情况。体外实验:细胞分为6组:正常组,氧合血红蛋白组,氧合血红蛋白组+TRPC si RNA组,氧合血红蛋白组+TRPC overexpression组,氧合血红蛋白组+CN激动剂治疗组,氧合血红蛋白组+CN拮抗剂治疗组。提取神经元细胞总蛋白以western blot的方法检测TRPC上调及下调的干预效果以及NMDAR磷酸化程度,提取神经元核蛋白以western blot的方法检测NFAT入核情况,以TUNEL染色的方法检测神经元的凋亡率,以LDH活性测定的方法检测神经元的坏死情况,以CN活性测定方法检测TRPC1&4表达对CN活性的调控。结果:1.在SAH后72h,TRPC1&4蛋白水平的上调后CN活性显著增高(p<0.01),TRPC1&4下调后CN活性显著降低(p<0.05)。2.TRPC1&4上调后NMDAR的磷酸化程度降低(p<0.05),TRPC1&4下调后NMDAR磷酸化程度增高(p<0.05)。3.SAH后72h,TRPC1&4的si RNA组NMDAR磷酸化水平升高(p<0.05),si RNA+CHA处理组NMDAR磷酸化水平较si RNA组低(p<0.01);TRPC1&4的过表达质粒组NMDAR磷酸化水平降低(p<0.05),过表达质粒+FK506组NMDAR磷酸化水平较过表达质粒组高(p<0.01)。4.CN活性上调后胞核内的活化T细胞核因子(NFAT)蛋白水平升高(p<0.05),同时细胞总蛋白中TRPC1和TRPC4的蛋白水平升高(p<0.01);CN活性下调后胞核内的NFAT蛋白水平下降(p<0.05),同时细胞总蛋白中TRPC1和TRPC4的蛋白水平下降(p<0.01)。结论:在SAH后EBI过程中TRPC1&4的蛋白水平显著上升,随之CN活性增高,CN抑制NMDAR的磷酸化,从而阻断了磷酸化NMDAR的神经毒性。而当TRPC1&4被下调时,CN活性降低,NMDAR磷酸化程度增高,随之神经毒性加剧。此证实了CN作为TRPC1&4调节作用的中间环节的猜想,即TRPC1&4通过CN来调节NMDAR磷酸化过程,从而发挥神经保护作用的。TRPC1&4正反馈自我调控的特性说明CN和NFAT具有协同作用。