背景与目的：肾细胞癌是人类常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤,包括多种不同的病理亚型,其中肾透明细胞癌最常见,绝大部分为散发性,约占肾细胞癌的70-80%。已知其发生和3号染色体短臂3p25上的VHL基因失活密切相关,且VHL基因失活被认为是肿瘤发生的早期事件。肾透明细胞癌具有较大的异质性,不同肿瘤间从组织学形态到生物学行为往往有很大区别。同一肿瘤内有时亦会观察到组织形态的异质性,在文献中具有这种现象的肿瘤也被称为混合性肿瘤,既低级别的肿瘤中突然出现高级别成分。为什么会出现这种现象,是什么机制导致这种现象产生,尚无明确解释。我们猜想在肾透明细胞癌中,除VHL外一定有其他分子改变,导致了不同肿瘤之间甚至同一肿瘤内的异质性。在细胞生命活动的选择性基因沉默或基因表达过程中,DNA序列一般不发生改变,但染色质结构可以发生高度动态的变化,而这种由于染色质结构的动态变化而引起的基因转录活性改变称为染色质重塑。染色质重塑的机制主要有两种类型：一种是共价化学修饰,另一种是ATP依赖的物理修饰,主要通过ATP依赖的染色体重塑复合物完成,这些复合物利用ATP水解产生的能量促进染色质构象发生改变。酵母交换型转换/蔗糖不发酵(yeast switch in mating type/sucrose non fermentation, SWI/SNF)复合物是一种ATP依赖的染色质重塑复合物,是90年代初在对酿酒酵母的研究中发现的,故而得名。该复合物由约11个亚基组成,其核心成员包括BRM(SMARCA2)、 BRG1 (SMARCA4)、INI1 (SMARCB1、SNF5或BAF47)、ARID1A(BAF250A或SMARCF1)和]PBRM1 (BAF180)。SWI/SNF复合物在基因表达过程中通过调节组蛋白的位置促进DNA动态变化,暴露DNA功能位点,促使DNA与相关转录因子及其它关键蛋白结合,调控基因表达。SWI/SNF染色质重塑复合物在胚胎发育、组织再生、细胞衰老、细胞凋亡和癌症抑制等多方面发挥了重要作用。目前越来越多的证据表明SWI/SNF染色质重塑复合物缺陷和肾癌的发生发展密切相关：INI1蛋白的失活会导致一组具有横纹肌样形态特征的高度恶性肿瘤如100%肾横纹肌样瘤、15%集合管癌及100%肾髓质癌等。41%的肾透明细胞癌具有PBRM1基因突变,使得PBRM1成为继VHL之后肾癌的第二相关基因。最近有研究证明,ARID1A蛋白和mRNA水平在67%肾透明细胞癌中下调,且和预后不良相关。BRM是SWI/SNF染色质重塑复合物的催化亚基关键蛋白,其失活发生在10—20%的实体性肿瘤包括肺癌、前列腺癌及胃癌等,但其在肾细胞癌中的表达情况未见文献报道。本课题分析BRM在肾细胞癌中的表达情况。旨在(1)明确BRM在肾透明细胞癌中的缺失比例,进一步研究BRM失活型肾癌的临床病理特征。(2)探讨BRM失活型肾癌的分子病理学特点。(3)进一步明确BRM在肾透明细胞癌中的失活机制。材料和方法：对625例透明细胞癌进行BRM蛋白免疫组化筛查,筛选BRM阴性病例。通过临床资料回顾、免疫组织化学、光镜观察等方法对BRM失活型肾透明细胞癌的临床病理特点进行观察研究；利用PCR、DNA测序和FISH等方法,探讨BRM失活型肾透明细胞癌的分子病理学特点,着重探讨VHL基因和3号染色体短臂(3p)的改变；利用DNA测序、FISH和甲基化特异性PCR等方法,进一步研究BRM在肾透明细胞癌中的失活机制。结果：BRM在39.6%(19/48)低分化G4级肾透明细胞癌中表达缺失。19例BRM阴性肾癌患者年龄32～73岁,平均54.5岁。男女比1.1：1。患者均无VHL病、结节性硬化症及镰状红细胞病等病史。患者均进行了肾脏完全切除。肿瘤分期示2例Ⅱ期、8例Ⅲ期及9例Ⅳ期；11例(59%)肿瘤累及肾周脂肪组织,5例(26%)肿瘤伴肾静脉侵犯,4例(21%)具有淋巴结转移,6例(32%)出现远隔转移,转移部位包括肺、肝脏和骨。14位患者获得随访信息,随访时间为4-49个月,平均19个月。6位患者无病生存,8位患者死于肿瘤。肿瘤致死率为57%。BRM阴性肾透明细胞癌具有差分化特征如细胞核极度多形的间变性形态、横纹肌样特征或肉瘤样改变,间质内常见淋巴细胞及组织细胞浸润和大片坏死。其中13例为纯差分化形态,6例为间变性或横纹肌样形态(G4)伴低级别(G1或G2)透明细胞癌混合存在。透明细胞癌区域占整个肿瘤30—50%。按文献中说法,我们将13例同时伴有高级别间变性或横纹肌样特征和低级别透明细胞的肿瘤称为混合性肿瘤。值得一提的是,混合性肿瘤中仅差分化成分BRM表达缺失,低级别肿瘤成分BRM阳性表达。所有肿瘤阳性表达CKpan、CA-IX、和vimentin; SMA、TFEB、TFE3、HMB45、cathepsin K、CK7和CD117阴性。CD10、P504S、Ksp-cadherin在不同病例或同一病例的不同成分间表达不一致。BRM阴性肾癌免疫组化与透明细胞癌高度一致。为了进一步检测肿瘤的分子病理学特征并探讨肿瘤的起源,我们对19例BRM阴性肾癌进行了VHL基因测序。另有7例BRM阳性的混合性肿瘤以及10例BRM阳性的纯差分化肾癌作为对照组也纳入实验。结果发现9/19(47%)BRM阴性肾癌和9/17(53%)BRM阳性对照病例存在VHL基因突变,两组突变率无统计学差异。在混合性肿瘤中,不同的形态学成分均存在相同的突变,提示其相同起源。以上36例行VHL突变检测的病例同时也进行了3p FISH检测。FISH检测在两例混合性肿瘤中未能成功(例17和例19)。其余BRM阴性病例中,88%(15/17)发生了3p缺失,对照组94%(16/17)发生了3p缺失,两组缺失率无统计学差异。成功检测的34例肿瘤的所有差分化成分均存在3号染色体多倍体现象,相反所有11例混合性肿瘤的低级别透明细胞癌区域均为2倍体。虽然混合性肿瘤中高级别肿瘤细胞和低级别肿瘤细胞的3号染色体倍数不同,但对3p缺失的判读结果是一致的,提示3p缺失在肾透明细胞癌的发生中是一早期事件,而在此基础上,高级别肿瘤成分继发了其他分子改变,如染色体倍数扩增。BRM缺失的机制研究中发现,78.9%存在BRM突变、43.8%存在9p缺失或9号染色体单倍体、42.8%存在BRM基因启动子区CpG岛甲基化,89.5%至少存在一项BRM基因异常,47.4%存在两项以上异常。表明BRM在肾透明细胞癌中的失活是由BRM基因突变、9号染色体短臂缺失以及BRM启动子区CpG岛甲基化共同参与所致。对6例混合性肿瘤的检测发现,4例BRM突变的肿瘤中,突变仅位于差分化区域。3例混合性肿瘤中,9p缺失同样仅位于低分化区域。这样的结果进一步提示,BRM缺失是肿瘤去分化的重要因素,在肿瘤的进展中起重要作用。结论：一、BRM在39.6%(19/48)低分化G4级肾透明细胞癌中表达缺失,在G1-G3级透明细胞癌中均阳性表达,蛋白缺失与肿瘤级别显著正相关。二、BRM阴性肾癌的免疫表型和分子病理学参数高度符合肾透明细胞癌。三、BRM阴性的肾癌致死率高,预后差,是否将其作为高级别肾透明细胞癌中的一个特殊亚型,有待于进一步研究。四、相较于BRM基因,VHL基因突变和3号染色体短臂缺失在肾透明细胞癌中是一早期事件。五、在混合性肿瘤中,不同分化的肿瘤区域呈现出分子水平的同源性,而高级别的肿瘤成分又继发了额外的分子改变。六、BRM基因突变、9号染色体短臂缺失以及BRM启动子区CpG岛甲基化的共同影响,至少可以解释部分肾透明细胞癌中的BRM蛋白缺失。七、BRM缺失可能是一部分差分化透明细胞癌的二次打击位点,并在肿瘤的进展和演进中起重要作用。