论文部分内容阅读
目的乳腺癌居现代女性癌症发生的首位,对女性的生命健康造成了严重的影响。化疗是乳腺癌最重要的治疗方法之一。然而在给予化疗后,部分患者疗效不佳,容易出现化疗抵抗,这是乳腺癌治疗的重要阻碍。化疗药物在调控肿瘤干细胞化特征及耐药性产生等方面发挥的作用尚未彻底阐明。乳腺癌细胞分泌的外泌体是一类直径在30-150nm的细胞外囊泡,其所荷载的RNA、DNA、蛋白及脂质等参与调控细胞与细胞间相互作用。外泌体源性microRNA(miRNA)在调控肿瘤干细胞自我更新和分化过程中发挥着重要的作用。本研究旨在探讨化疗药物诱导乳腺癌细胞分泌外泌体及其所装配的miRNA调控肿瘤干性的相关机制,进而为治疗肿瘤化疗耐药提供潜在的靶点。方法1.应用化疗药物多西他赛和多柔比星及PBS分别处理乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、BT474以及人正常乳腺细胞MCF 10A,分别提取纯化外泌体,处理对应的乳腺癌细胞。肿瘤干性成球实验和ALDEFLUOR实验来检测肿瘤干细胞化特征,RT-PCR检测干性相关基因NOTCH1、SOX9、NANOG和OCT4的mRNA水平,westernblot检测经化疗诱导乳腺癌或正常乳腺细胞源性外泌体处理后对应乳腺癌细胞中干性基因的蛋白水平变化。2.利用小RNA测序技术检测化疗药多西他赛和多柔比星诱导MDA-MB-231细胞来源的外泌体中miRNA表达增高的情况。RT-PCR验证筛选出的3种miRNA即miR-9-5p、miR-203a-3p和miR-195-5p在上述3种乳腺癌细胞以及人正常乳腺细胞中经化疗诱导的表达水平。RT-PCR和westernblot检测经化疗诱导的乳腺癌和正常乳腺细胞源性外泌体处理乳腺癌细胞后ONECUT2表达情况。利用3种miRNA抑制剂分别阻滞乳腺癌源性外泌体的作用后检测ONECUT2和相关干性基因mRNA和蛋白表达水平。3.使乳腺癌细胞过表达miR-9-5p、miR-203a-3p和miR-195-5p后,成球实验和ALDEFLUOR实验检测肿瘤干性特征变化,RT-PCR和westernblot检测相关干性基因mRNA和蛋白表达情况。利用小干扰RNA(siRNA)敲低ONECUT2表达水平或应用ONECUT2过表达质粒转染乳腺癌细胞,肿瘤干性成球实验和ALDEFLUOR实验来检测肿瘤干细胞化特征变化,RT-PCR和westernblot检测干性基因的表达情况。4.构建双荧光素酶报告基因载体,检测ONECUT2是否为miR-9-5p、miR-203a-3p和miR-195-5p共同的靶基因。5.利用MDA-MB-231、外泌体分泌减低的MDA-MB-231/Rab27aKD和过表达ONECUT2的MDA-MB-231/OC-2的乳腺癌原位NSG小鼠模型在体内研究化疗诱导乳腺癌源性外泌体在调控ONECUT2和干性基因表达中所起的作用。腹腔注射化疗药物多西他赛15mg/kg,测量肿瘤大小并绘制肿瘤生长曲线。利用RT-PCR检测化疗前后荷瘤鼠血清外泌体中miR-9-5p、miR-203a-3p和miR-195-5p的表达。RT-PCR和westernblot分别检测肿瘤组织中ONECUT2和干性基因的mRNA及蛋白表达变化。IHC检测Ki-67、ONECUT2和干性指标SOX9表达情况。6.MTS实验检测ONECUT2敲低或上述3种miRNA过表达后MDA-MB-231细胞化疗耐药性及ATP结合盒式转运蛋白(ABC转运蛋白)的表达。结果1.应用化疗诱导乳腺癌细胞释放的外泌体能够促进乳腺癌干性成球能力和ALDH+细胞的比例,同时诱导了干性基因NOTCH1、SOX9、NANOG和OCT4的高表达。而正常人乳腺细胞MCF 10A经化疗后未产生上述诱导作用。2.小RNA测序结果显示,与PBS对照组相比,miR-9-5p、miR-203a-3p和miR-195-5p在化疗诱导MDA-MB-231来源的外泌体中呈现显著高表达。RT-PCR结果表明在MDA-MB-231、MCF-7和BT474细胞中均呈现了化疗诱导的外泌体源性3种miRNA的高表达,而在MCF 10A细胞中表达未增加。根据靶基因预测软件,3种miRNA共同预测靶基因是转录因子ONECUT2。经化疗诱导肿瘤源性外泌体处理后,ONECUT2表现为mRNA和蛋白水平表达下调。应用3种miRNA抑制剂后,可抵消上述外泌体诱导的ONECUT2和干性基因表达变化趋势。3.过表达miR-9-5p、miR-203a-3p和miR-195-5p可增强肿瘤干细胞化特征。敲低ONECUT2表达能促进成球能力,增加ALDH+细胞比例和上调干性基因表达水平。反之过表达ONECUT2可致与上述相反结果。4.双荧光素酶报告实验显示,miR-9-5p、miR-203a-3p和miR-195-5p能靶向ONECUT2的3’UTR区,ONECUT2是上述miRNA的共同作用靶基因。5.NSG鼠体内实验证实,化疗后,MDA-MB-231荷瘤鼠血清miR-9-5p、miR-203a-3p和miR-195-5p表达增加,肿瘤组织中ONECUT2表达减低,干性相关基因表达增强。外泌体分泌减低的MDA-MB-231/Rab27aKD小鼠经化疗后血清上述3种miRNA未显示升高,ONECUT2和干性基因表达无上述变化。ONECUT2过表达小鼠化疗后亦无上述变化。6.MTS实验结果显示,ONECUT2低表达和3种miRNA高表达可诱导肿瘤化疗抵抗作用增强,该过程中ABC转运蛋白ABCB1、ABCC1、ABCG2和ABCC5表达水平增加。结论1.化疗诱导乳腺癌外泌体源miR-9-5p、miR-203a-3p和miR-195-5p表达增加,通过直接靶向转录因子ONECUT2,下调其表达水平,进而调控肿瘤干细胞化特征增强,包括促进肿瘤干性成球能力,增加ALDH+细胞比例以及上调干性基因表达。2.ONECUT2低表达和上述3种miRNA过表达可增强乳腺癌MDA-MB-231细胞干性化特征以及对化疗药物的耐受性,该过程中ABC转运蛋白的表达增高。