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结肠癌的发病率和致死率居高不下,严重危害我国人民的生命健康,为社会保障制度造成严重负担。化疗是进展期的结肠癌尤其是转移性结肠癌的主要治疗方法,目前仍基于伊立替康或奥沙利铂结合氟尿嘧啶/亚叶酸等小分子药物治疗方式,平均生存期仅有18个月。BRAF作为丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径的重要一环,是人类最重要的原癌基因之一,调控肿瘤细胞增殖、分化、迁移、存活和血管生成。BRAF基因突变所致的结肠癌在进展期结肠癌中约占10%,其化疗效果较差,缺乏最佳治疗方案,整体生存期显著少于BRAF基因未突变患者,且化疗后的耐药、复发和转移成为患者死亡的主要原因,是目前结肠癌化疗的面临的主要挑战之一。虽然BRAF靶向抑制剂在BRAF基因突变的结肠癌患者治疗的初期可取得较好的疗效,但是在治疗后期MAPK信号通路的再活化可导致进一步的耐药和不良预后。因此,深入研究和探讨BRAF基因突变所致化疗耐药的相关靶点和分子机制,并筛选相关靶向干预药物,有望实现对该类结肠癌亚型患者精准有效治疗,并将有效提高BRAF基因突变结肠癌患者的生存期。研究表明转移性结肠癌中绝大多数BRAF基因突变所致是由于600位密码子A和T发生了置换,进而翻译过程中缬氨酸替换了谷氨酸（故称V600E突变）造成蛋白表达的错乱,此类患者平均生存期仅21个月,显著低于非V600E BRAF突变的患者（39.4个月）。在课题组前期工作中,我们以BRAF基因V600E突变型结肠癌细胞和野生型结肠癌细胞为研究对象,对多种一线结肠癌化疗药物和天然活性物质的敏感性进行了筛选和比较,发现氟尿嘧啶（Fluorouracil,5-FU）在上述两种细胞中的敏感性差异最大。5-FU作为结肠癌一线药物使用已久,研究表明其联合奥沙利铂、伊立替康与贝伐单抗可部分消除BRAF基因突变引起的不良预后,但5-FU作用于BRAF基因V600E突变结肠癌的作用及机制尚不清楚。因此,本论文将进一步研究氟尿嘧啶造成BRAF基因V600E突变型结肠癌细胞和野生型结肠癌细胞的敏感性差异的作用,并深入探讨潜在的分子机制。研究目标:阐明在结肠癌中BRAF基因V600E突变对氟尿嘧啶敏感中的重要作用,揭示Bcl-xL在结肠癌中BRAF基因V600E突变对氟尿嘧啶敏感中特异性下调的相关机制,旨在为BRAF突变的结肠癌患者的治疗机制提供理论及实验基础。方法与结果:1.明确BRAF基因突变型结肠癌细胞对氟尿嘧啶具有敏感性以一对具有BRAF等位基因RKO细胞株（结肠癌BRAF野生型细胞株和BRAF基因V600E突变型细胞株）为研究对象,通过MTT法考察氟尿嘧啶、紫杉醇、卡铂、依维莫司、黄连素、刺囊酸和常春藤皂苷元等不同类型药物对结直肠癌细胞活性的影响并计算IC50,后以流式细胞技术、Hoechst 33258细胞核染色法比较BRAF基因V600E突变型和野生型对氟尿嘧啶的敏感性差异,探讨BRAF基因V600E突变型细胞对氟尿嘧啶引起细胞凋亡的影响作用。结果表明,在受试各类药物中,氟尿嘧啶对BRAF基因V600E突变与野生型细胞存活率影响的敏感性最高,且氟尿嘧啶在BRAF基因V600E突变型结肠癌细胞中IC50更小,并可诱导更强的细胞凋亡作用。结果显示,BRAF基因突变型结肠癌细胞对氟尿嘧啶具有敏感性。2.BRAF突变能显著下调Bcl-xL的表达以促进氟尿嘧啶引起的线粒体凋亡以配对的BRAF基因V600E突变型和野生型细胞株为模型,通过免疫印迹法技术分别研究氟尿嘧啶对BRAF基因V600E突变与野生型细胞中线粒体凋亡通路caspase-3/-8/-9的影响。结果表明,氟尿嘧啶处理两种细胞后,caspase-3/-9发生裂解,而Cleaved caspase-8表达无影响。以上结果表明,BRAF突变能显著增强氟尿嘧啶引起的线粒体凋亡。在此基础上,通过荧光定量RT-PCR分析和免疫印迹法技术探讨氟尿嘧啶对BRAF基因突变中Bcl-2家族的mRNA和蛋白表达水平的影响;并应用siRNA技术、流式细胞技术、荧光实时定量qRT-PCR分析和免疫印迹法技术等,研究BRAF基因突变对氟尿嘧啶处理细胞中Bcl-xL蛋白表达水平的影响,同时探讨BRAF未突变情况下敲减Bcl-xL对细胞凋亡的影响。结果表明,BRAF基因突变显著下调Bcl-xL的mRNA和蛋白表达;Bcl-xL沉默能显著增强氟尿嘧啶对BRAF野生型细胞的凋亡的影响,且能有效激活线粒体凋亡通路。以上结果提示,Bcl-xL表达下调是BRAF基因突变对氟尿嘧啶敏感性特异性上调的主要原因之一。3.氟尿嘧啶作用后,BRAF基因突变能明显抑制肿瘤的生长以配对的BRAF基因V600E突变型和野生型细胞株进行裸鼠肿瘤移植,给予氟尿嘧啶后测量肿瘤体积,观察BRAF基因的突变对氟尿嘧啶抗肿瘤作用的影响;行以免疫印迹技术,比较氟尿嘧啶作用后,BRAF基因V600E突变对Bcl-xL的mRNA和蛋白表达水平的影响。结果表明,氟尿嘧啶可有效地抑制裸鼠BRAF突变移植瘤的生长,且能下调BRAF突变移植瘤细胞中Bcl-xL的mRNA和蛋白的表达,差异均有统计学意义。以上结果表明,BRAF基因V600E突变可显著增强氟尿嘧啶的抗肿瘤活性,并在体内实验中证实该抗肿瘤活性是通过下调Bcl-xL下调实现的。结论:本研究在细胞和动物水平揭示了BRAF野生型细胞和突变型结肠癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性差异,并证实氟尿嘧啶处理后的BRAF基因突变的结肠癌细胞特异性下调Bcl-xL表达,激活线粒体凋亡通路,将为提高临床BRAF基因突变的结肠癌患者的治疗提供新思路和新药物。