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背景：乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,在欧美国家乳腺癌的发病率占女性恶性肿瘤的首位,近5096乳腺癌患者治疗后复发转移。控制转移是治愈乳腺癌的关键。最近的研究表明miRNA在肿瘤的转移过程中发挥重要作用。我们课题组前期的研究发现,在高转移能力的SK-3rd球囊细胞中miR-30和let-7都缺失或下调,上调let-7能抑制乳腺癌干细胞的体内转移;生物信息学预测发现miR-30和let-7拥有共同的靶基因:整合素β3(Integrinβ3,ITGB3),提示miR-30和let-7有可能在乳腺癌转移中发挥重要作用。
目的：探讨miR-30和let-7对乳腺癌细胞侵袭和转移的调控作用,鉴定其直接作用的靶基因,阐明其调控乳腺癌细胞转移的作用机制,为发展新型的抗乳腺癌基因药物奠定基础。
方法：采用定量PCR、western blot方法检测高转移乳腺癌细胞miR-30d和let-7a及ITGB3 mRNA和蛋白表达；转染miR-30d和let-7amimics,观察对乳腺癌细胞ITGB3 mRNA和蛋白表达及转移能力的影响;构建miR-30和let-7的sensor及miR-30位点突变载体,采用双荧光素酶报告系统进行检测,验证miR-30和let-7对ITGB3的直接作用。
结果：⑴与低转移能力的亲本细胞SKBR3细胞相比,具有较高转移能力的3rd球囊细胞miR-30d显著低表达,ITGB3 mRNA和蛋白显著高表达;与无转移能力的MCF-7细胞相比,高转移的MDA-MB-435s细胞miR-30d和let-7a显著低表达,ITGB3 mRNA和蛋白显著高表达。⑵转染miR-30d后MDA-MB-435s细胞ITGB3 mRNA和蛋白显著下调,转染let-7a组细胞ITGB3 mRNA和蛋白均下调,以蛋白下调更为显著。⑶野生型psi-CHECK2-ITGB-3UTR分别与miR-30d和let-7a共转染48小时后,荧光素酶活性明显受抑制(p＜0.01),其中miR-30d组荧光素酶活性抑制率接近50％;miR-30d与突变了miR-30结合位点的psi-CHECK2-ITGB-3UTR-mut共转染48小时后,荧光素酶活性没有明显变化,而let-7a组荧光素酶活性抑制率仍大于60％。⑷在体外粘附实验中,MDA-MB-435s细胞经转染miR-30d和let-7a干预后粘附细胞数明显减少,在体外迁移和侵袭实验中,miR-30d和let-7a干预后过膜细胞明显少于阴性对照组。
结论：miR-30和let-7能靶向ITGB3抑制乳腺癌细胞转移。①高转移性乳腺癌细胞miR-30和let-7表达下调,ITGB3 mRNA和蛋白上调,二者呈负相关；②miR-30下调ITGB3 mRNA和蛋白表达,let-7能抑制ITGB3蛋白表达,部分作用mRNA水平;miR-30和let-7能靶向结合ITGB3mRNA；③miR-30和let-7对乳腺癌细胞体外粘附、迁移、侵袭均有抑制作用。