【背景及目的】支气管哮喘（哮喘）是由多种细胞因子以及细胞群参与的慢性炎症性疾病，而其发病机制尚未明确。目前主要以临床药物控制为主，免疫过敏原特异性免疫治疗公认为最有效的治疗，但仍有如过敏反应，过敏原的标准化不足，疗程长，很多时候，患者依从性差等弊端，从而影响疗效。所以寻找更安全和有效的免疫治疗方法是当今其中一个预防过敏性疾病防治的热点。研究表明，哮喘发病机制和辅助性T细胞1、2（Thl/Th2）细胞因子失衡、调节性T细胞（Tregs，regular T cells）及辅助性T细胞17（Th17，T help cell17）/白细胞介素17（IL-17）等反常相关；而白介素35（IL-35）是新近发现的一种细胞因子，与Tregs及Th17/IL-17等免疫调节作用密切相关，通过多种渠道参与哮喘的发病机制及调控，有望成为哮喘的治疗新靶点，也已成为近年研究的热点。研究证实，IL-35可以有效地提高Treg亚群的发挥抑制作用，抑制Th17细胞的增殖分化，抑制过度的免疫反应，抑制免疫损伤等作用，因此我们认为IL-35可能对支气管哮喘等变态反应性疾病具有免疫调节和治疗作用。本实验拟重组构建小鼠IL-35其真核表达载体，并将其转染至中华仓鼠卵巢细胞（CHO细胞），随后筛选出稳定表达IL-35蛋白的细胞株，利用镍柱（Ni-NTA）纯化培养细胞的上清，最后将纯化所得有活性的IL-35蛋白腹腔注射干预小鼠哮喘模型，察看小鼠哮喘动物模型经过激发后，哮喘急性发作及其对气道炎症的影响，但愿可以表明重组IL-35在过敏性哮喘等变态性疾病中的免疫调节功能的机制，探讨其在变态反应疾病的免疫治疗中的应用前景。【内容及方法】第一部分真核载体pSectag2A-IL-35的构建与表达从J774细胞中获得编码小鼠IL-12的p35亚基（IL-12p35或p35）和EB病毒诱导基因3（EBI3）cDNA片段，退火获得Linker，先后插入真核质粒pSectag2A中。重组质粒pSectag2A-IL-35测序正确后，转染CHO细胞，反复筛选后获得高效表达的细胞株，收集上清，浓缩后亲和层析获得纯化的重组IL-35蛋白。第二部分IL-35对小鼠哮喘动物模型的免疫调节作用1、建立小鼠哮喘动物模型：SPF级的12只C57BL/6小鼠，随机分为对照组和哮喘组，每组6只。（1）致敏：哮喘组每只小鼠分别于第0和第7d腹腔内注射0.2mL生理盐水（NS），其中含10μg卵蛋白（OVA）和2.25mg氢氧化铝凝胶（AL（OH）3）；对照组仅予以0.2mL的NS中仅含2.25mg AL（OH）3。（2）激发：哮喘组于第14¹8d雾化吸入10mL NS（含5%OVA），30min/d，对照组仅吸入10mL NS。（3）末次雾化24小时，予以1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后颈部脱臼处死，采集肺泡灌洗液（BALF）和肺组织标本，检测BALF中淋巴细胞、嗜酸性粒细胞数量及上清中细胞因子IL-4、IFN-γ的表达量；同时肺组织H&E染色检测炎性细胞浸润。2、 IL-35对小鼠哮喘动物模型的免疫影响：SPF级的18只C57BL/6小鼠，随机分为3组，A组：正常对照组；B组：哮喘组；C组：IL-35治疗组；每组6只。（1）致敏：哮喘组及IL-35治疗组每只小鼠分别在第0和第7d腹腔注射0.2mL NS含10μgOVA和2.25mg AL（OH）3；A组仅予以0.2mL的NS中仅含2.25mg AL（OH）3。（2）干预：C组于第7¹3d腹腔注射重组IL-35蛋白，10μg/d/mouse。（3）激发：B组及C组于第14¹8d雾化吸入10mL NS（含5%OVA），30min/d，A组仅吸入10mL NS，30min/d。（4）检测：末次雾化24h后，以1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后脱臼处死，收集BALF和肺组织，分别对各组小鼠BALF中白细胞总数、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞数目进行计数，同时检测BALF上清中细胞因子IL-4、IL-17、TGF-β、IFN-γ的表达量；同时肺组织H&E染色及免疫组化检测肺组织中叉状头转录因子P3（FoxP3）和IL-17蛋白的表达；最后对检测结果进行分析。【研究结果】1、以J774细胞总RNA为模板，应用RT-PCR克隆EBI3及p35cDNA，经琼脂糖凝胶电泳在624bp、576bp处均可见单一条带，大小与预计相符合。测序结果与Genbank（NM₀15766.2、NM₀01159424.1）中公布的序列一致；并通过退火获得51bp的Linker，与文献报道一致[19]。2、将两者分别通过TA克隆连接至载体pSectag2A中，最后将Linker连接至pSectag2A-EBI3-p35，构建为重组质粒pSectag2A-IL-35，经PCR鉴定证实了目的基因的插入，经酶切鉴定、引物测序证实读码框完整，无移码突变，重组质粒构建成功；用Fugene9转染至CHO细胞中，并用Zeocin筛选稳转株，筛选18d获得的转基因细胞CHO/pSectag2A-IL-35，利用镍柱纯化细胞培养上清液，SDS-PAGE在46.3kDa处可见一条带，Western-Blot分析可见同样大小的特异条带，且能与组氨酸（HIS）标签抗体抗或IL-12p35特异性抗体结合，表明成功建立细胞系CHO/pSectag2A-IL-35，并获得小鼠IL-35蛋白。3、成功建立哮喘模型。致敏前后，观察哮喘组和对照组小鼠的外观和行为以及对刺激的反应、活动和体重均无明显差异。激发后第2d哮喘组小鼠雾化时出现抓鼻挠腮行为，停止雾化后逐渐消失，第4d，哮喘组小鼠雾化时出现安静少动、点头呼吸、前肢缩抬、弓背、大小便失禁等现象。对照组皮毛干净有光泽，正常饮食，活动灵敏。末次雾化24h后收集标本进行检测，结果显示，哮喘组较对照组BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞比例增高、细胞因子IL-4含量升高和IFN-γ含量下降；H&E染色示肺部炎性细胞浸润增加；这与哮喘患者的经典发病机制相类似。结果表明，建立小鼠哮喘模型，可以应用于研究其调控哮喘免疫调节与治疗作用。4、 IL-35治疗后，B组BALF中IL-4、IL-17、TGF-β表达显著高A组，C组IL-4、IL-17、TGF-β表达水平回降，低于B组，但高于A组，而IFN-γ在BALF中的表达与前三者相反，差异均有统计学意义（P＜0.05）。H&E染色结果提示C组小鼠肺部炎性细胞浸润较B组显着降低，高于A组以嗜酸性粒细胞为主，差异均有统计学意义（P＜0.05）。免疫组织化学结果显示，C组FoxP3阳性细胞数最低，与文献[17]报道的IL-35诱导型调节型T细胞（iTr35）不表达FoxP3相一致；B组的IL-17阳性表达显著升高，高于A组和C组。结果示，经腹腔注射重组IL-35，可显著抑制哮喘动物模型的气道炎症，并可上调Tregs增殖分化、抑制IL-17的表达，表明了重白介素35对哮喘小鼠的免疫调节和治疗作用。【结论】1、通过PCR调取IL-35基因，利用分子克隆技术插入pSectag2A分泌型表达质粒中，成功构建了pSectag2A-IL-35重组真核表达载体。2、利用最佳转染条件以及Zeocin抗性筛选标记，筛选出能高效稳定表达鼠源性IL-35蛋白的CHO/pSectag2A-IL-35细胞系。利用蛋白质亲和纯化手段，制备出足量的有效应的小鼠重组IL-35。3、所制备的小鼠重组IL-35能明显抑制哮喘气道炎症反应，有望成为变态反应性疾病免疫治疗的新靶点。