第一部分慢性压力刺激对结肠癌上皮间质转化及肿瘤干细胞特性的影响研究目的明确慢性压力刺激对结肠癌上皮间质转化及肿瘤干细胞特性的影响。研究方法为探索慢性压力刺激对肠道肿瘤发生发展的影响,我们利用BALB/c小鼠构建慢性压力模型,并通过旷场实验和检测外周血中压力应激相关激素的水平验证慢性压力模型的构建效果。随后以AOM/DSS诱导慢性压力模型小鼠及正常小鼠肠道肿瘤的发生,比较两组小鼠肠道肿瘤的数量。随后为了探索慢性压力刺激对AOM/DSS诱导的肠道肿瘤上皮间质转化及肿瘤干细胞特性的影响,我们利用免疫组织化学（IHC实验）技术检测两组小鼠肠道组织中肿瘤干细胞相关指标（CD133,CD44）,EMT相关指标（E-cadherin,vimentin）及p53蛋白的表达情况。利用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测慢性压力模型小鼠外周血中主要的肾上腺应激激素（包括皮质醇,去甲肾上腺素和肾上腺素）的浓度,确定了肾上腺素（EPI）在慢性压力刺激中升高最为明显。在p53野生型结肠癌细胞系HCT116和Lovo中,以EPI刺激,通过蛋白质印记法（western blot实验）检测EPI对p53野生型结肠癌细胞中p53蛋白、EMT及肿瘤干细胞相关蛋白表达的影响。随后进一步通过体内实验验证上述实验结果,应用裸鼠皮下异种移植瘤模型实验及western blot实验和IHC实验检测EPI对裸鼠皮下异种移植瘤生长、p53蛋白的表达以及EMT转化和肿瘤干细胞特性相关蛋白的影响。研究结果慢性压力刺激能够促进结肠癌细胞的EMT转化和肿瘤干细胞特性。长期慢性压力刺激可促进AOM/DSS诱导的结肠肿瘤的发生,免疫组化结果显示慢性压力模型小鼠肠道组织中p53蛋白表达量显著降低,肿瘤干细胞标志物CD133和CD44显著升高,EMT相关上皮样标志物E-cadherin明显降低,间质标志物vimentin明显升高。酶联免疫吸附实验分别检测两组小鼠外周血不同肾上腺应激激素的含量,实验结果表明慢性压力模型小鼠外周血中皮质醇,去甲肾上腺素和肾上腺素的浓度均有不同程度的升高,且以肾上腺素升高最为明显。在p53野生型结肠癌细胞系中,经低剂量的EPI长时间处理后,p53蛋白表达降低,间质特征蛋白N-cadherin和vimentin表达明显升高,上皮特征蛋白E-cadherin表达水平明显降低,同时肿瘤干细胞相关指标CD133和CD44蛋白表达水平显著升高。在裸鼠皮下成瘤实验中,腹腔注射EPI后结肠癌细胞的成瘤能力明显增强,且皮下肿瘤组织中,IHC实验结果显示,p53蛋白表达降低,间质特征蛋白vimentin表达明显升高,上皮特征蛋白E-cadherin表达水平明显降低,同时肿瘤干细胞相关指标CD133和CD44蛋白表达水平显著升高。结论长期慢性压力刺激可促进结肠癌细胞的上皮间质转化及肿瘤干细胞特性。第二部分慢性压力刺激促进结肠癌细胞上皮间质转化及肿瘤干细胞特性的机制研究研究目的进一步阐明慢性压力刺激调控肠道p53蛋白表达以及促进结肠癌细胞上皮间质转化和肿瘤干细胞特性的分子机制,为阐释结肠癌的发病机制和探索结肠癌的治疗策略提供新的理论依据。研究方法通过裸鼠皮下成瘤实验,检测不同肾上腺素能受体激动剂或抑制剂对裸鼠皮下肿瘤生长的影响,明确肾上腺素作用于结肠癌细胞表面的主要受体。使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）、蛋白酶体抑制剂（MG132）处理结肠癌细胞,利用western blot实验和蛋白质免疫共沉淀（co-IP）实验技术探索EPI对p53蛋白的调控方式。利用western blot实验和球细胞培养实验验证EPI通过调控p53进而影响结肠癌细胞的EMT转化及肿瘤干细胞特性。通过转录组测序技术筛选出受EPI调控的E3连接酶TRIM2,并通过western blot实验和q RT-PCR实验进一步验证。在HCT116和Lovo细胞中转染经慢病毒包被的小干扰RNA（si RNA）或转染过表达质粒用以敲低或过表达TRIM2,通过western blot实验和球细胞培养实验检测TRIM2对结肠癌细胞p53蛋白的表达、EMT转化及肿瘤干细胞特性的影响。使用CHX、MG132处理结肠癌细胞,验证TRIM2对p53蛋白泛素化降解的调控作用。对TRIM2蛋白和p53蛋白行蛋白质免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验,观察其在结肠癌细胞系中的相互结合和细胞亚结构中共定位的情况。根据TRIM2蛋白和p53蛋白的结构域,构建包含不同结构域的标签质粒,通过co-IP实验技术来探究TRIM2蛋白与p53蛋白直接结合的结构域。随后我们利用western blot实验和q RT-PCR进一步探索TRIM2 m RNA水平的改变是否受转录因子p53的调控,并通过染色质免疫共沉淀（Ch IP）和双荧光素酶报告基因技术来验证p53蛋白是否通过与TRIM2基因启动子区域直接结合进而影响TRIM2启动子的转录活性。最后通过western blot实验和球细胞培养实验验证了TRIM2是否能介导EPI对p53蛋白的表达、EMT转化及肿瘤干细胞特性的调控。研究结果慢性压力刺激能够通过影响p53蛋白的稳定性进而调控结肠癌细胞的EMT转化以及肿瘤干细胞特性。其具体分子机制为,慢性压力刺激导致肾上腺素释放增多并通过细胞表面的β2肾上腺素能受体（ADRB2）影响结肠癌细胞的EMT转化及肿瘤干细胞特性;肾上腺素可以促进p53蛋白的泛素化降解,过表达p53可逆转肾上腺素对结肠癌细胞EMT转化及肿瘤干细胞特性的影响。而TRIM2作为受肾上腺素调控的E3连接酶,参与了肾上腺素对p53蛋白的泛素化调控。TRIM2通过其RING结构直接结合p53蛋白促进p53的泛素化,同时,p53作为转录因子,可反馈调控TRIM2m RNA的表达水平,抑制TRIM2基因的转录。敲低TRIM2蛋白可逆转肾上腺素对结肠癌细胞中p53蛋白的表达、结肠癌细胞的EMT转化及肿瘤干细胞特性的影响。结论长期慢性压力刺激可促进结肠癌的发生发展。慢性压力状态下,肾上腺素分泌增加,通过作用于细胞表面的ADRB2进而促进结肠肿瘤的发生发展。在结肠癌细胞中,长期低剂量的肾上腺素刺激可增强TRIM2的转录活性,促进TRIM2蛋白的表达。TRIM2蛋白通过其RING结构域同p53蛋白的DBD和TAD结构域直接结合,促进p53的泛素化,不稳定蛋白p53降解增多,细胞内的p53蛋白水平降低,进而促进了结肠癌细胞的EMT转化及肿瘤干细胞特性。综上所述,我们的研究探索了长期慢性压力刺激同结肠癌发生发展的关系,揭示了压力诱导的肾上腺素释放通过TRIM2/p53途径促进结肠癌的发生与发展,为进一步探索结肠癌发生发展的机制提供了新的理论依据。