真菌毒素寡核苷酸适配体的筛选与应用

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SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment in virto)即体外指数富集配体的系统进化技术,是在90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。适配子即aptamer,是对筛选得到的寡核苷酸序列的定义,因其可以与目标物质以配体-配基的形式结合,采用拉丁语aptus适合之意而得名。目前,已报道的真菌毒素的检测方法多种多样,但各有其优缺点。本文结合应用磁珠负筛SELXE技术和反筛SELEX技术筛选得到了黄曲霉真菌毒素B1和B2的单链DNA适配子并与荧光特性相结合建立了黄曲霉B1和B2的检测新方法。另外基于核酸适配子高特异性识别原理以及新兴纳米变色技术建立了对食品中真菌毒素FB1可视化检测新方法。首先,制备载体氨基化的磁珠,把靶物质黄曲霉毒素B1连接在载体上,以两端固定中间有40个随机序列在体外合成的一个全长80bp的寡核苷酸序列作为ssDNA文库。前两轮做磁珠的负筛,最后两轮做结构相似的物质黄曲霉毒素B2的反筛,运用FluMag-SELEX技术经过十轮反复筛选,将筛选得到的序列进行克隆测序。运用DNAMAN软件和RNAstructure软件对合成的AFB1适配子进行一级结构和二级结构分析。挑出不同源的几条具有代表性的适配子进行合成并标记生物素。制备亲和素包被的磁珠进行亲和性和特异性实验以及建立对黄曲霉毒素B1的检测方法。在优化条件下,目标物质浓度在50ng/L-1500ng/L范围内与荧光强度呈良好的线性关系,检出限35ng/L,在花生油中的加标回收率为94.2%到101.2%,回收率良好。其次,以真菌毒素黄曲霉毒素B2作为靶标,用同样的固定方法和文库,前两轮做磁珠的负筛,最后两轮做结构相似的物质黄曲霉毒素B1的反筛,运用Fulg-SELEX技术经过十轮反复筛选后进行克隆测序。结构分析,挑选不同源的AFB2适配子进行合成并用生物素标记,亲和性和特异性的分析以及检测方法的建立。在优化条件下,目标物质浓度在90ng/L-1800ng/L范围内与荧光强度呈良好的线性关系,检出限为55ng/L。在花生油中的加标回收率为93.1%到97.3%,回收率良好。再次,本研究基于核酸适配体识别和纳米金变色效应构建了伏马菌素B1(FB1)的可视化检测新方法。实验以纳米金为载体,首先在纳米金表面组装巯基化的适配体互补短链DNA1-FB1-适配体复合物;当加入目标物时,适配体链与目标物结合,与互补短链DNA1发生解离;此时再加入纳米金标记的与适配体互补短链1互补的短链DNA2,二者杂交可导致纳米金粒子的聚集而使溶液颜色发生变化,进而实现目标物的可视化检测。通过条件优化,有效避免了由于盐浓度过大使纳米金发生聚集所产生的误差。同时在纳米金与短链DNA孵化时加入表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS),使NaCl浓度达到了500mmol/L而纳米金颜色仍不发生改变,打破了以往熟化NaCl浓度100mmol/L就使纳米金颜色发生变化的界限,使附着在纳米金上的DNA量扩大了3倍。方法检测线性范围为125ng/L—1500ng/L,检测限为125ng/L。该方法已成功应用于啤酒中FB1的检测。
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