目的:狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)是系统性红斑狼疮最常见且严重的并发症,也是继发性肾病导致终末期肾衰竭的常见病因之一。狼疮性肾炎常见的病理变化是系膜细胞增殖和系膜基质增多,并伴有炎性细胞浸润。系膜细胞是肾小球内最活跃的固有细胞,多种细胞因子可以刺激系膜细胞增生,而持续的系膜细胞增生,必然引起细胞外基质合成增多,成分异常和肾小球硬化。Periostin是一种分泌型细胞间基质蛋白,表达在胶原丰富的组织,绑定到胶原-I、胶原-V、纤连蛋白、腱生蛋白-C、肝素等,参与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的结构,是αvβ1、β3、β4和β5整合素的配体。Periostin具有重要的生理功能,可以介导细胞和基质的粘附,调节一定的细胞行为,包括细胞内信号转导,增殖和分化,调节细胞粘附和基质沉积等。Periostin能够诱导心肌细胞进入有丝分裂,促进肿瘤细胞增殖、存活、迁移和侵袭,并与心肌纤维化和支气管哮喘粘膜下纤维化,肝纤维化有关;参与多种炎性疾病如鼻窦炎,过敏性皮炎,哮喘,肝炎,动脉粥样硬化等;与多种自身免疫性疾病如类风湿关节炎,系统性硬化病,强直性脊柱炎等的发病及进展相关。多种细胞因子和生长因子都可以诱导periostin的表达,如IL-1β,IL-4,IL-13,IL-17,TGF-β1,PDGF-BB,Ang-II等。Periostin在正常肾脏几乎不表达,在糖尿病肾病,单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral occlusion,UUO)鼠模型的肾脏远端小管表达,在狼疮性肾炎,Ig A肾病的肾小球有表达,但其在狼疮性肾炎中的具体作用及在发病机制和病程进展中的作用未见进一步的研究。本研究拟以狼疮性肾炎模型MRL/faslpr小鼠和小鼠系膜细胞为研究对象,探讨periostin在狼疮性肾炎肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质增生中的作用及其可能的作用机制,并采用电穿孔技术对小鼠进行活体转染,检测敲低periostin表达对小鼠肾小球病变和肾功能的改善情况,为狼疮性肾炎的病因研究和靶向治疗提供依据。方法1狼疮性肾炎模型小鼠肾组织periostin、PCNA、Fn、TGF-β1的表达水平检测24周龄MRL/MPJ小鼠6只作为对照组(Control组),MRL/faslpr小鼠6只为狼疮性肾炎组(LN组)。留取24h尿液,内眦动脉取血后处死小鼠,取肾脏皮质,部分肾组织置于4%多聚甲醛固定液中固定,用于光镜、免疫组织化学、免疫荧光检测;部分肾皮质组织置于液氮保存,用于肾小球目的蛋白检测。常规病理染色技术观察肾小球形态结构;免疫荧光和免疫组化技术及Western blot检测肾组织periostin、PCNA、Fn、TGF-β1蛋白的表达;半自动生化分析仪检测血Scr、BUN和24h尿蛋白生化指标。ELISA方法检测血清PDGF-BB水平。2体外培养小鼠系膜细胞增殖和细胞外基质增生水平的检测及与periostin表达水平的关系小鼠系膜细胞在37℃、5%CO2条件下,给予含10%胎牛血清的DMEM/F12(3:1)培养基培养。脂质体介导向细胞内转染sh-periostin沉默质粒和periostin表达质粒,Western blot检测小鼠系膜细胞periostin蛋白表达水平。⑴检测PDGF对periostin表达及系膜细胞的增殖和细胞外基质的影响:细胞以6孔板培养24h后换含10ng/ml PDGF刺激物的培养基,分别于刺激2h、4h、6h、12h时收集细胞提取细胞总蛋白。western blot检测periostin、PCNA、Fn、TGF-β1蛋白的表达水平。⑵检测转染periostin表达质粒对系膜细胞的增殖和细胞外基质的影响:细胞随机分为对照组(Control组)、空质粒转染组、periostin表达质粒组,24h后收集细胞,Western blot和免疫细胞化学检测细胞蛋白periostin、PCNA、Fn、TGF-β1表达水平。⑶转染periostin沉默质粒检测PDGF引起的系膜细胞增殖和细胞外基质生成是否通过periostin起作用:细胞随机分为对照组,PDGF组,PDGF+空质粒组和PDGF+sh-periostin沉默质粒组。细胞以10 ng/ml PDGF孵育6h,收集4组细胞提取细胞总蛋白。Western blot检测细胞蛋白periostin、PCNA、Fn、TGF-β1表达水平。3敲低MRL/faslpr小鼠肾皮质periostin的表达,检测小鼠肾脏细胞增殖和细胞外基质增生水平及蛋白尿水平的变化24周龄MRL/MPJ小鼠6只设为对照组(Control组),18只等周龄等体重MRL/faslpr小鼠随机分为狼疮性肾炎组(LN组),对照质粒干预组方法:(LN+sh-NC组)和sh-periostin质粒干预组(LN+sh-periostin组)。电穿孔技术向治疗组小鼠肾脏皮质转染干扰质粒。3周后留取24h尿液和取血清后处死小鼠,取肾脏皮质,部分肾组织置于4%多聚甲醛固定液中固定,用于光镜、免疫组织化学和免疫荧光检测;部分置于液氮保存,用于肾小球目的蛋白水平检测。常规病理染色技术观察肾小球形态结构;免疫荧光、免疫组化技术和Western blot检测肾皮质periostin,PCNA、Fn、TGF-β1蛋白的表达;半自动生化分析仪检测血Scr、BUN和24h尿蛋白生化指标。4 PDGF诱导periostin在体外培养小鼠系膜细胞的表达及与PI3K/Akt信号通路的关系PDGF相关信号通路检测:细胞以10 ng/ml PDGF孵育0h、30min、2h、4h、6h和12h,收集不同时间点细胞,Western blot检测信号通路相关因子p-Akt-ser473,Akt的表达。PI3K/Akt信号通路在PDGF诱导periostin表达及促进系膜细胞增殖和细胞外基质增生中的作用:细胞分为Control组,PDGF组,PDGF+DMSO组,PDGF+LY294002组,细胞以20 umol/L LY294002或DMSO孵育1h,10ng/ml PDGF孵育6h收集细胞,Western blot检测periostin、p-Akt-ser473、Akt、PCNA、Fn、TGF-β1表达水平。结果1 Periostin、PCNA和Fn、TGF-β1在LN组小鼠肾组织的表达水平升高。⑴与Control组相比,LN组小鼠血BUN水平明显增高,血Scr水平无明显改变,24小时蛋白尿水平明显增高。⑵光镜下观察,与Control组相比,LN组小鼠肾小球体积增大,细胞数增多。PAS染色显示对照组没有明显的细胞外基质积聚,而在狼疮性肾炎模型组小鼠肾小球细胞外基质积聚明显增加。⑶免疫荧光检测显示,在Control组小鼠肾组织中,periostin在肾小球细胞的细胞浆中微弱表达,而在LN组小鼠肾小球细胞的细胞浆中表达明显增强;免疫组化显示PCNA阳性信号在Control组和LN组小鼠肾小球细胞核均有表达,后者表达明显强于前者。Fn在Control组小鼠肾小球中无明显表达,在LN组肾小球、肾小管及间质中有明显的阳性表达。TGF-β1在Control组小鼠肾小球中无明显表达,而在LN组肾小球中有明显的阳性表达。⑷Western blot结果表明,与Control组相比,LN组小鼠肾皮质periostin、PCNA、Fn、TGF-β1蛋白的相对表达量均显著高于Control组。⑸ELISA结果显示,与Control组相比,LN组血清PDGF-BB水平明显增高。2 Periostin作为PDGF的下游因子上调体外培养小鼠系膜细胞的增殖水平和增加细胞外基质合成。⑴PDGF时间依赖性上调periostin蛋白表达。Western blot结果显示,PDGF刺激组periostin蛋白表达显著高于Control组。PDGF刺激2h后periostin水平开始升高,并于6h达到高峰,12h periostin水平明显回落;细胞免疫荧光检测结果显示,在对照组,periostin在胞浆微弱表达,PDGF刺激组periostin在胞浆表达明显增强。⑵PDGF上调小鼠系膜细胞增殖水平和细胞外基质表达。Western blot结果显示,PDGF刺激组PCNA蛋白表达显著高于Control组,PDGF刺激2h后小鼠系膜细胞PCNA水平开始升高,并于6h达到高峰;12h明显回落;PDGF刺激组小鼠系膜细胞Fn、TGF-β1蛋白表达明显升高,PDGF刺激4h后Fn、TGF-β1蛋白表达明显增加,6h仍明显增高,12h明显回落。⑶periostin表达质粒使系膜细胞periostin、PCNA表达明显增强,Fn、TGF-β1蛋白表达明显增加。Western blot与免疫细胞化学检测结果显示与未转染细胞和转染空质粒细胞相比,转染periostin表达质粒的小鼠系膜细胞periostin蛋白表达明显增高,同时PCNA的表达明显增强,Fn、TGF-β1蛋白表达明显增加。⑷periostin沉默质粒部分逆转PDGF引起的系膜细胞增殖和细胞外基质表达。Western blot和细胞免疫荧光检测结果显示,与PDGF刺激的未转染组和转染空质粒组比较,转染sh-periostin质粒使periostin的蛋白表达显著下降,并使PCNA的蛋白表达明显下降。Western blot结果显示periostin沉默质粒下调PDGF引起的Fn、TGF-β1蛋白表达。3敲低periostin表达有效降低LN组小鼠肾小球细胞增殖和细胞外基质增生水平及尿蛋白水平。⑴sh-periostin质粒有效下调狼疮模型小鼠肾皮质periostin蛋白表达。免疫荧光和Western blot检测结果显示,与LN组和LN+sh-NC组小鼠相比,sh-periostin组小鼠肾小球periostin蛋白的表达明显降低。⑵敲低肾组织中periostin表达降低了狼疮模型小鼠肾小球细胞增殖水平。肉眼观察,MRL/faslpr各组小鼠肾脏体积、质量均无明显变化。光镜下观察,与LN组和LN+sh NC组相比,sh-periostin组小鼠肾小球细胞数目有所减少,但仍高于Control组。免疫组化和Western blot检测结果显示,与LN组和LN+sh-NC组小鼠相比,sh-periostin组小鼠肾小球PCNA蛋白的表达明显降低。⑶敲低肾组织中periostin表达能够降低狼疮模型小鼠肾小球细胞外基质增生水平。PAS染色结果显示,与LN组和LN+sh-NC组小鼠相比,sh-periostin组小鼠肾小球系膜区细胞外基质积聚减少,但仍高于Control组。免疫组化和Western blot检测结果显示,与LN组和LN+sh-NC组小鼠相比,sh-periostin组小鼠肾小球Fn、TGF-β1蛋白表达明显降低。⑷敲低肾组织中periostin表达能够降低狼疮性肾炎模型小鼠尿蛋白水平。生化检测结果显示,与LN组小鼠相比,sh-periostin组小鼠24h尿蛋白量明显降低,血Scr、BUN水平无明显变化。4 PDGF通过激活PI3K/Akt信号通路来诱导periostin的表达,从而进一步引起系膜细胞增殖和细胞外基质表达增加。⑴PDGF促进小鼠系膜细胞中PI3K/Akt信号通路的活化。Western blot结果显示,PDGF刺激小鼠系膜细胞后30min p-Aktser473出现表达高峰,2h和4h时表达仍持续升高,6h开始明显下降,仍高于对照组,至12h时,p-Aktser473表达水平回落至正常水平。⑶PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002能够抑制PDGF诱导的p-Aktser473、periostin、PCNA、Fn、TGF-β1的表达。Western blot结果显示,与PDGF刺激组相比,PDGF+LY294002组较PDGF+DMSO组p-Aktser473、periostin、PCNA、Fn、TGF-β1表达明显降低。结论1狼疮性肾炎模型小鼠肾组织中periostin,PCNA、Fn、TGF-β1的表达水平明显升高,而采用电穿孔转染技术沉默肾组织中periostin表达能够降低肾小球细胞增殖水平,减少细胞外基质积聚,减轻蛋白尿,提示periostin可能通过上调系膜细胞增殖和细胞外基质增生水平参与狼疮性肾炎的发病及病变过程。2 PDGF诱导periostin在体外培养的小鼠系膜细胞表达增加,并上调系膜细胞增殖水平和细胞外基质表达水平。periostin表达质粒促进体外培养的小鼠系膜细胞增殖,细胞外基质合成增加。periostin沉默质粒部分逆转PDGF引起的系膜细胞增殖和系膜细胞Fn、TGF-β1蛋白表达。PDGF通过激活PI3K/Akt信号通路诱导periostin表达,细胞增殖和细胞外基质积聚。上述结果提示,PDGF—Akt—periostin通路参与调控狼疮性肾炎的肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质增多。