目的:研究雌激素缺乏不同时间段痴呆模型小鼠脑内雌激素受体(Estrogen receptors,ERs)及糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β)的动态变化,并观察丙戊酸钠(valproic acid sodium salt,VPA)联合雌激素对APP/PS1双转基因去势AD模型小鼠脑内雌激素受体含量及GSK-3β相关信号通路的影响,探讨相关的作用机制。本课题研究成果将为进一步揭示AD的发病机制及临床上研究和开发治疗AD的多靶向药物提供新的实验室依据。方法:本课题分两部分进行。第一部分:选取3月龄雌性APP/PS1双转基因小鼠40只,将其随机分为假手术组(AD-Sham组)和手术组(AD-OVX组),同月龄野生型小鼠为对照组(WT组),每组10只。分别于术后1个月和术后5个月,采用多种方法检测小鼠外周血雌激素水平、行为学、脑组织形态学及相关蛋白的变化。第二部分:选取去势后1个月痴呆模型小鼠进行药物治疗,随机平均分为6组:生理盐水对照组、VPA药物处理组、E2药物处理组、Liq药物处理组、VPA联合E2药物处理组及VPA联合Liq药物处理组,每组8只。vpa药物处理组小鼠给予药物vpa30mg/kg·d,雌激素药物处理组给予e2药物2.4ug/只·d,liq治疗组给予liq50ug/kg·d,vpa和e2联合治疗组给予vpa30mg/kg·d和e22.4ug/只·d,vpa和liq联合治疗组给予vpa30mg/kg·d和liq50ug/kg·d,生理盐水治疗组给予等量生理盐水,除liq给药方式为灌胃外,其余给药均为腹腔注射。药物处理1个月后,采用高架十字迷宫及旷场实验以检测各组小鼠的抑郁焦虑行为;morris水迷宫检测小鼠的空间学习及记忆能力;利用蛋白印迹(westernblot)等技术,检测联合用药对小鼠脑内雌激素受体含量,gsk-3β活性及老年斑的影响,并探讨其相关机制。结果:1.第一部分实验结果:ovx1个月和5个月组ad小鼠体循环雌激素水平显著下调(p<0.05);ovx1个月组小鼠子宫无明显缩小,而ovx5个月出现明显萎缩。morris水迷宫显示,ovx1个月后,与ad-sham组相比,ad-ovx组小鼠找到平台的逃避潜伏期和路程显著增加(p<0.05),跨越平台的次数明显减小(p<0.05)。随着ovx时间的延长,至ovx5个月后,ad-ovx组小鼠找到平台的时间和经过的路程更进一步延长(p<0.05),跨越平台的次数也相应下降(p<0.05)。免疫荧光结果显示,与ad-sham组相比,ad-ovx1个月和5个月组小鼠脑内老年斑均显著增加(p<0.05)。westernblot结果显示,与ad-sham组相比,ad-ovx1个月及5个月组小鼠脑内erβ蛋白水平出现进行性下调(p<0.05);相应地,ad-ovx组小鼠脑内p-gsk-3β水平降低的趋势与erβ一致(p<0.05),尽管正常小鼠和ad小鼠脑内gsk-3β总蛋白无明显差异(p>0.05)。2.第二部分实验结果:1、行为学1)高架十字迷宫检测结果显示:联合药物处理组小鼠在开放臂活动次数明显增多(p<0.05),联合药物处理组在开放臂停留的时间与其余各组相比均明显延长(p<0.01)。在开放臂活动次数及开放臂停留时间的比率上,vpa与e2联合处理组均明显增加(p<0.01),liq处理组也明显增加(p<0.05);vpa与e2,vpa与liq联合处理组较vpa及e2单独药物处理组也显著增加(p<0.05)。2)水迷宫实验结果:可视平台条件下,各组药物处理小鼠找到平台的时间和路程均无明显的差异(p>0.05)。隐蔽平台实验条件下,其他各药物处理组小鼠找到隐蔽平台的游动时间及路程与生理盐水对照组相比均明显缩短(p<0.05);而联合药物处理组游动时间及距离更加缩短(p<0.05)。空间探索实验中,与生理盐水组比较,联合药物处理组穿越平台的次数明显增多(p<0.01),单一药物处理组也明显增多(p<0.05);与联合药物处理组比较,vpa处理组和liq处理组均明显减少(p<0.05),e2处理组显著减少(p<0.01)。2、各组小鼠子宫形态及重量统计结果显示:各药物处理组小鼠子宫在外观形态上均有不同程度的增大,统计分析结果得出,vpa组,liq组与control组相比,子宫重量无明显变化(p>0.05);e2组,vpa+e2组,vpa+liq与control组相比,子宫重量显著增加(p<0.01)。e2组,vpa+e2组小鼠子宫形态与其余各组相比明显增生,重量也显著增加(p<0.05),并有大小形状不一的结节形成。3.蛋白水平实验结果:(1)雌激素受体α与β与生理盐水组比较,大脑皮质区erα蛋白含量在联合药物处理组中显著上升(p<0.01),在各单独药物处理组中无明显差异(p>0.05)。与生理盐水对照组相比,大脑海马区erα蛋白水平在vpa药物处理组中无明显变化(p>0.05),在其余各药物处理组中均显著增多(p<0.05)。在erβ含量的比较中,与生理盐水对照组相比,其余各药物处理组大脑皮质及海马区内erβ含量均显著增多(p<0.05),且联合药物处理组大脑皮质及海马区内erβ的含量比各药物单独处理组明显增多(p<0.05)。(2)gsk-3β活性检测:与生理盐水对照组相比,其余各单独药物处理组小鼠脑皮质及海马区gsk-3β总蛋白水平均无明显差异(p>0.05),联合药物处理组脑皮质区gsk-3β总蛋白水平显著下降(p<0.05),而脑海马区内gsk-3β总蛋白水平无明显差异(p>0.05)。其第9位点磷酸化水平标志着gsk-3β活性的高低,与生理盐水对照组相比,vpa组、e2组脑皮质区pser9-gsk-3β水平均无明显差异(p>0.05),liq组及联合药物处理组脑皮质区pser9-gsk-3β水平明显升高(p<0.05);而在各组脑海马区pser9-gsk-3β水平的比较中,与生理盐水对照组相比,其余各药物处理组pser9-gsk-3β水平均明显升高(p<0.05),且与各单独药物处理组相比,联合药物处理组pser9-gsk-3β水平也显著升高(p<0.05)。结论:1、卵巢切除手术后,ad小鼠体循环雌激素水平随年龄增长呈下降趋势,子宫形态随年龄增长逐渐萎缩。2、卵巢切除手术后,AD小鼠空间学习记忆能力随年龄增长逐渐下降。3、卵巢切除手术后,AD小鼠脑内Aβ的沉积及老年斑的形成增多,其可能机制可能是与ERβ含量下降所导致的GSK-3β活性异常有关。4、药物处理明显改善了去势AD小鼠的抑郁焦虑行为,缓解了其空间学习记忆能力的下降,且联合用药的效果明显优于单一药物处理。5、药物处理显著增加了去势AD小鼠脑皮质及海马区雌激素受体的含量,且联合用药的效果更显著。6、药物处理显著增加了去势AD小鼠脑皮质及海马区p ser9-GSK-3β的含量,使GSK-3β的活性受到了抑制,且联合用药的效果更显著。