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实验背景:肝细胞癌(HCC)是世界上最致命的癌症之一,也是临床上最常见的原发性肝癌。目前研究表明,能量代谢的改变是癌症细胞的表征之一。与正常细胞不同,肝癌细胞中的葡萄糖摄取率增加并且有氧糖酵解反应增强,此现象我们称为Warburg效应。能量代谢的改变通常会导致肝癌细胞侵略性增加和患者预后性差。因此,抑制肝癌细胞的葡萄糖摄取和糖酵解具有重要意义。华蟾毒它灵(Cinobufotalin)是在蟾蜍毒液中发现的丁二烯内酯,科学研究表明Cinobufotalin具有良好的抗肿瘤活性。本实验主要探讨Cinobufotalin是否影响肝癌中的葡萄糖摄取及有氧糖酵解?其分子作用机制是什么?本课题将为肝癌临床治疗提供新的策略。实验方法:首先使用Cinobufotalin处理Hep G2和SNU-739细胞48 h,CCK-8实验检测Cinobufotalin对肝癌细胞活性的影响;使用流式细胞术检测Cinobufotalin对细胞凋亡影响;Westerrn blot实验检测Cinobufotalin处理Hep G2和SNU-739细胞48 h对凋亡相关蛋白(PARP、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、BCL-2)表达的影响;运用Western blot法检测Cinobufotalin对肝癌细胞中缺氧诱导因子蛋白(HIF-1α)和糖酵解反应蛋白(GLUT1、p-PKM2、HK2、PKM2)的表达影响;利用瞬时转染法,构建HIF-1α低表达的Hep G2和SNU-739细胞模型,基于上述细胞模型,验证Cinobufotalin对HK2、GLUT1、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达的影响;鉴于以上实验结果,验证Cinobufotalin是否能恢复Hep G2/ADM细胞对阿霉素的敏感性;构建BALB/c小鼠腋下接瘤肝癌模型,体内动物实验评估Cinobufotalin、阿霉素及联合用药对肿瘤组织抑制的效果;HE染色和免疫组化实验检测Cinobufotalin对肝癌组织凋亡的影响;通过免疫组织化学法,评估小鼠肿瘤组织中HIF-1α与GLUT1蛋白的表达变化。实验结果:1.通过CCK-8实验,结果证明Cinobufotalin呈浓度依赖性显著抑制Hep G2和SNU-739细胞的增殖。2.流式细胞实验结果说明Cinobufotalin可显著诱导Hep G2和SNU-739细胞发生凋亡,并呈浓度依赖性。3.Western blot实验结果显示Cinobufotalin能够显著上调凋亡蛋白(Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、BCL-2、PARP)的表达。4.Western blot实验表明Cinobufotalin处理Hep G2和SNU-739细胞48 h后,能够抑制HIF-1α蛋白的表达,同时下调葡萄糖代谢相关蛋白(GLUT1、HK2、PKM2)的表达。5.基于Hep G2/ADM耐药细胞模型的研究表明,Cinobufotalin可以诱导Hep G2/ADM细胞凋亡,抑制耐药细胞株的糖酵解,并能够增强阿霉素抑制Hep G2/ADM细胞增殖的作用。6.基于BALB/c小鼠腋下接瘤肝癌模型研究表明,Cinobufotalin能抑制小鼠体内实体瘤的生长;HE和IHC结果显示Cinobufotalin可干扰实体瘤细胞的糖酵解过程,促进肝癌细胞凋亡,并且联合用药效果更明显。实验结论:Cinobufotalin通过抑制HIF-1α介导的Warburg效应诱导肝癌细胞凋亡。