人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)是一种常见的疱疹病毒，在人群中普遍感染，儿童感染率约为10％-40％，成人为50％-90％，大部分感染者为无临床症状的健康人。但机体免疫功能低下的人群如器官移植患者及AIDS病人，更易发生HCMV病毒的新发或复发感染，引起致命疾病如肺炎、肝炎、脑炎等，从而导致器官移植失败及术后死亡;同时HCMV病毒也是宫内感染中危害最大的病毒之一，感染率占怀孕妇女的0.5％-2％，尤其是在发展中国家较为常见，孕妇感染后自身多无明显症状或轻微症状，但是病原体可以通过胎盘传染给胎儿，引起死胎、早产、流产或胎儿先天性神经管缺陷，因此HCMV的预防及治疗迫在眉睫。CMV病毒是人类疱疹病毒基因组中最大的包膜病毒，由于缺乏HCMV感染的动物模型及完整的病毒蛋白抗原，且抗体功能的鉴定手段有限，科学家们很难准确地确定中和表位。因此，在中和表位不明的情况下，过去多种疫苗的研制在临床实验中由于难以诱导出持续且高效的中和抗体水平而被宣告失败。为了得到有效的防治型疫苗并开发治疗性中和抗体，了解自然感染人群的体液免疫反应以及探索天然感染病毒表面的中和优势表位就显得尤为重要。本论文的主要目标是获取HCMV自然感染者的特异性全人抗体库、对其进行一系列反应及功能性鉴定，并以此为基础探索天然感染的抗体应答。本研究结果可为HCMV疫苗的研制提供实验依据，也可为HCMV的诊断及治疗提供新的手段。同时获取全人抗体平台的成功建立将有助于开发出更多有价值的诊断或治疗用抗体，具有可移植和可扩展性。本研究是采用人记忆B细胞培养的途径，从三名HCMV自然感染志愿者中获得HCMV特异型全人抗体库，测定中和活性，分析其基因学特征，再结合高通量深度测序来探索HCMV自然感染的体液免疫应答。　　本论文的第一部分旨在摸索及优化人记忆B细胞体外培养的条件以促进其增殖分化为分泌IgG的浆细胞，方便后续利用B细胞培养上清进行抗原特异性检测。首先，本部分通过实验比较，选择了最优的记忆B细胞纯化试剂盒EasySepTM Human Memory B Cell Isolation kit，能富集出纯度为90％以上的记忆B细胞;接着通过一系列平行条件的预实验确定了记忆B细胞体外刺激分化的模式，优化了B细胞的各培养条件，得到记忆B细胞分化与增殖的最佳条件为:1.44个B细胞/孔、50Gy剂量辐射的4×104 cell/孔的HEK293-CD154饲养细胞、hIL-2150 ng/mL并使用10％FBS的RPMI1640培养基培养14天;此次研究中donor1所获的IgG阳性孔中，63％分泌IgG的分泌量≤0.1μg/mL（OD值＜1.5），34.5％分泌IgG的分泌量0.1-1μg/mL（OD值＞1.5），只有约2.5％阳性孔分泌的IgG含量＞1μg/mL（OD值＞1.5）。最后，本研究中三个志愿者记忆B细胞培养后所产生IgG的阳性率（OD值＞1.5）分别为37％，37％及23％。同时，通过实验证实抗原特异性阳性孔必定为IgG阳性孔，但IgG阳性孔不一定全为抗原特异性孔，大多数抗原特异性较高的孔，其IgG含量也较高，但抗原特异性OD值与IgG分泌量并不成正比关系。　　本研究的第二部分旨在建立从B细胞中扩增抗体可变区基因并重组表达全人抗体的平台。此部分首先通过对抗体保守区域前导序列及恒定区的比对，确定了轻重链可变区基因特异性引物的设计方案;并在使用特异性引物的基础上，利用高效的RNA提取试剂盒及cDNA反转录试剂盒获得记忆B细胞的cDNA，接着优化了cDNA使用浓度、选择了合适的DNA聚合酶(Primestar GXL)，成功的扩增出清晰且亮度较强的分别为300-400 bp及400-500 bp的重链、轻链可变区目的条带。最后重链可变区的扩增成功率为91％，kappa及lambda轻链可变区基因扩增的成功率分别为79％及67％，轻链可变区基因的总体成功率为93％。将测序正确的轻重链可变区基因克隆至带有轻重链恒定区的真核表达载体，并在HEK293中瞬时共转染及小量表达，检测为阳性的抗体再进行大量的无血清表达及纯化，获得纯度为95％的目标抗体。　　本研究的第三部分是从三名HCMV自然感染志愿者中获得了65株HCMV全人抗体并对其进行性质鉴定。此部分通过对抗体基因的扩增及重组得到了65株HCMV全人抗体，其中donor1、donor2、donor3来源的抗体各占23株、17株及25株，且gB特异性抗体的数量较多(38/65)。65株全人抗体中有33株中和抗体，同时gB特异性中和抗体为16株，gH五聚体特异性中和抗体为17株;65株全人抗体中另有32株不具备中和能力的结合抗体，其中大多为gB特异性抗体（22株），而gH五聚体特异性抗体及其他表位结合抗体各5株。设定NT50=0.1μg/mL作为优秀中和抗体的界限，发现15株优秀中和抗体中的14株(93％)均为gH五聚体特异性抗体（NT50＜0.1μg/mL），只有1株优秀中和抗体为gB特异性，因此HCMV病毒诱导强有力的中和活性与gH五聚体有关。以EC50=0.1μg/mL作为优秀病毒结合抗体的界限，在27株优秀病毒结合抗体中，74％为gB特异性抗体;而38株gB特异性抗体中53％为优秀的病毒结合抗体(EC50＜0.1μg/mL)，相比之下22株gH五聚体特异性抗体只有23％为优秀的病毒结合抗体(EC50＜0.1μg/mL)。因此较gH抗原及其它表位抗体，大部分gB特异性抗体的病毒结合能力较强，与gB抗原为病毒表面最为丰富的蛋白之一有关。另外，16株gB特异性中和抗体中，有4株抗体在有补体的情况下中和活性得到了显著提高，NT50数值降低10-20倍，说明部分gB特异性中和抗体具有补体依赖性，这可能与gB中和抗体活性较低，在发挥中和作用时需要补体激活作用以增强其中和功能相关。　　本研究的第四部分是从分子学水平上对65株全人抗体库进行基因型特征的描述。本研究通过对抗体轻重链胚系基因型的分析，获得了各特异性抗体轻重链的主要基因型，并且发现Kappa链抗体在抗原结合反应中(AD169 rev/gB/gH)表现较lambda抗体优异，但在中和反应中lambda抗体的中和活性比kappa抗体较强。通过对三个志愿者中和抗体及非中和抗体的重链CDR3比对后发现，donor1、donor2中和抗体的HCDR3长度均明显长于非中和抗体，但是donor3中并未出现，这与donor3血清中和滴度较低、保护性抗体较弱有关;相反，donor3中和抗体的可变区核苷酸突变数量明显多于非中和抗体，可能与其需要更多的高频突变产生有效的保护性抗体有关。与其他志愿者相比，仅donor1中出现了优势的结合及中和抗体家族;donor3中产生了多株非生物学配对的功能性抗体。通过邻接法建立gH五聚体及gB抗体的基因树发现，gH五聚体抗体基因树的平均置信度明显高于gB抗体基因树，说明病毒表面高丰度的gB蛋白较易产生基因型多样化的抗体，而病毒表面低丰度的gH五聚体蛋白较易产生基因相对保守的抗体。最后，利用最大似然法将三个志愿者的全人抗体各自建立系统发育进化树，每个志愿者轻重链基因大致分为1-4组B细胞谱系，各谱系组的划分大致符合抗体结构与功能之间的SAR(structural-function relationship，SAR)关系。　　本研究的第五部分是以65株全人抗体作为参考抗体，对各志愿者的B细胞库进行高通量深度测序以深入探索不同HCMV自然感染志愿者的不同抗体免疫应答。本部分以Illumina MiSeq测序平台为基础，从数据库的性状对同一志愿者的同一样本在不同公司BGI及Irepertoire获得的测序数据库进行比较，发现不同公司输出的数据库结果既具有同一性又具有差异性，其差异性绝大部分来自于所用的测序引物的不同。另外，以5RACE为基础的PGM深度测序也同时进行，其数据库特征与Irepertoire测序数据库较为相似但仍存在一定的差异。最后，以BGI数据库为基础，我们对全人抗体的进化发展进行初步探索分析，以最大似然法初步建立了donor1优势中和及结合抗体的轻重链系统发育进化树以描述其抗体家族的亲和力成熟路线。利用不同亲和力抗体的发展路线，初步确立高亲和力的中和或结合抗体常常位于亲和力成熟过程中进化靠前且较为成熟的支系;而在胚系基因相同的相关克隆序列中，低亲和力抗体进化相对滞后，在相应的功能性鉴定中表现相对较差。以Irepertoire数据为基础，我们初步探索不同亲和力中和抗体在不同时间点的进化过程，从重链进化过程发现只有高亲和力中和抗体的克隆系家族为机体提供有效的动态保护作用;而低亲和力的中和抗体家族在不同时间点之间无明显变化;同时不同亲和力抗体的轻链在不同时间点之间无明显进化区别，体现了HCMV中和抗体发展中重链进化的重要性，轻重链可变区氨基酸突变率的比较可证明此现象的存在。另外，在PGM测序的数据库基础上，65株参照抗体得到了全面系统的遗传谱系分析，经过对其热点图及其进化树的分析及比较，发现只有donor1中3株高亲和力gH五聚体特异性中和抗体(1-85、1-125、1-175)的轻重链具有同一克隆谱系的体细胞突变抗体序列，与最大似然法进化树中的抗体序列相互对应。　　综上，本论文为了探讨HCMV自然感染人群的体液免疫应答及探索病毒表面的优势中和表位，我们从三个自然感染HCMV的志愿者体内成功获得65株特异性全人抗体，对这些抗体进行结合反应及中和功能鉴定，证明gH/gL/UL128-131五聚体蛋白为HCMV病毒诱导出强有效中和抗体的优势表位。接着通过分析对65株全人抗体基因型及其B细胞克隆谱系进行深入的了解，同时通过深度测序初步探索不同志愿者在感染HCMV后产生的不同抗体反应，初步获取了优势中和及结合抗体的进化特点及其亲和力成熟的发展过程，进一步了解了自然感染人群的体液免疫是如何响应病毒周期性感染，中和抗体在控制复发或新发感染中是否起着关键作用等重要信息。总之，本研究为理解HCMV自然感染的抗体免疫应答提供了新的视角和思路，为研制防治型疫苗及HCMV治疗性抗体药物奠定了基础。