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重楼(ParispolyphyllaSmith)是延龄草科重楼属植物,其主要化学成分为薯蓣皂甙等甾体皂甙,具有祛痰、抗菌、镇痛、镇静活性;具有抗早孕和杀精活性;具有抗癌和止血等活性,是云南白药、宫血宁等多种中成药和新药的主要原料。然而,随着重楼自然资源的不断利用,其面临枯竭的威胁日益加剧,寻找新的、可再生的重楼替代资源已成为必然。国内外大量研究表明,内生菌(Endophyte)能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的代谢产物。分离出含有药用植物有效药用成分的植物内生菌,已成为一个新的研究热点。我们对产甾体皂甙的重楼内生细菌进行了研究,从微生物发酵的方向解决药用重楼野生资源不足的问题。
从华重楼(ParispolyphyllavarChinensis)的新鲜块茎中分离得到107株内生菌。对这107株菌进行了液体培养,经TLC初步检测鉴定,有多株菌产生甾体皂甙或其类似物。本文对其中2株菌进行了研究,编号分别为SS01和SS02。根据薄层检测结果,菌株次生代谢物与重楼总皂甙有显色相同、迁移率相当的层析带,初步表明其可能产生重楼甾体皂甙,需进一步研究菌株产生何种甾体皂甙及其是否具有重楼药用活性。
根据其形态及生长特征和生理生化特征,参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版),初步鉴定SS01是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌,SS02是芽孢杆菌属(Bacillus)细菌。进一步利用16SrDNA序列分析的方法对此2株菌进行了分子鉴定,菌株SS01和SS02的部分16SrDNA序列的GenBank接受号分别为AY842143、AY842144。用Blastn调出GenBank+EMBL+DDBJ中的同源序列,用ClustalW进行多序列比对,用Phylip、TreeView按照Neighbor-Joining法构建系统发育树。结果表明,SS01与AY493976(CedeceadavisaeDSM4568)距离最近,经ClustalW计算,二者同源性为98.9%,由此判断菌株SS01与CedeceadavisaeDSM4568同种,鉴定为CedeceadavisaeSS01;SS02的部分16SrDNA(1183bp)与AF391124的同源性为97.7%,表明SS02与Paenibacillusdaejeonensis同种,命名为PaenibacillusdaejeonensisSS02。
通过对菌株生长曲线的测定,菌株SS01在马铃薯液体培养基中生长处于对数期的时间在6-24h之间;菌株SS02在马铃薯液体培养基中生长处于对数期的时间在12-32h之间。
对SS02的发酵产物进行了初步的抗菌活性研究,结果表明:SS02的发酵液对13株植物致病真菌的生长有抑制作用。该菌发酵液抑菌谱广,有可能开发为人用、兽用、农用的抗真菌抗生素,或直接作为生物防治菌株,其应用开发潜力巨大。该抗茵活性物质是否与宿主重楼的抗菌物质相同或相似,同时该菌的抗菌物质是否与已报道的芽孢杆菌产生的抗菌物质相似,都须进一步研究该物质的分子结构,具有深入研究的价值,这也是一个很有意义的研究方向。