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甘露低聚糖是近年来国际上颇为流行的一种新型功能性低聚糖,它是由2~10个甘露糖通过糖苷键连接形成主链,再在主链上连接葡萄糖或半乳糖的杂聚寡糖。它能有效促进人体内有益细菌双歧杆菌的生长繁殖,调节肠道菌群平衡,增强人体免疫力等多种功能。可以通过魔芋葡甘露聚糖(简称:KGM)降解的方法获得葡甘露低聚糖。本论文通过对黑曲霉β-甘露聚糖酶的纯化,β-甘露聚糖酶的性质,β-甘露聚糖酶的固定化,固定化β-甘露聚糖酶的性质,填充床式反应器制备葡甘露低聚糖,葡甘露低聚糖的分离纯化等的研究,为工业化生产甘露低聚糖奠定基础。
采用40%~90%饱和度硫酸铵分级沉淀法;1.0:1~1.0:1.6(V/V)丙酮沉淀法;Sephadex G-100凝胶层析法。对β-甘露聚糖酶的粗酶液进行分步纯化,发现经纯化后的β-甘露聚糖酶的比活力达到7950.4U/mg,纯化倍数达到8.67,PAGE凝胶电泳显示单一条带。说明经这三步纯化以后已经得到电泳纯的β-甘露聚糖酶。纯化后的β-甘露聚糖酶最适pH为4.2、最适反应温度为60℃、在pH4.0~5.4范围内稳定、在温度小于65℃时,具有较好的热稳定性。
通过对两种固定化方法的筛选,选用一定浓度的戊二醛使甲壳素功能化,然后再与酶进行固定化,酶的活力回收率较高。当戊二醛浓度为0.8%;酶量为2000U/g载体;吸附时间为8h以上;固定时pH4左右;温度为4~20℃;载体活化时间为3h;活化温度为4℃。固定化酶的活力回收率为64.7%,固定化效果较好。固定化后的β-甘露聚糖酶耐酸、耐高温能力增强,其最适pH3.4、最适温度为75℃;在小于70℃范围内有良好的热稳定性;在pH3.4~5.4范围内稳定;固定化酶在4℃下保存10天后,剩余酶活力为79.4%,有较好的贮存稳定性。
对固定化β-甘露聚糖酶生物反应器进行初步设计,并应用设计的填充床式反应器制备葡甘露低聚糖,通过单因素试验和L<,16>(4<5>)正交试验,确定制备甘露低聚糖最佳的工艺条件:底物浓度为1.5%、加酶量为80×10<3>U/0.75g魔芋精粉、反应时间为5h、反应温度为75℃。在该工艺条件下葡甘露低聚糖最终得率为29.5%。五个因素:底物浓度、加酶量、反应时间、反应温度、底物pH对葡甘露低聚糖得率的影响主次顺序依次为:底物浓度>加酶量>反应时间>反应温度>底物pH。对001×7聚苯乙烯阳离子交换树脂分离葡甘露低聚糖参数的初步研究,结果表明:洗脱流速为2mL/min,温度为60℃,进料量为10mL,柱床高度为600mm时能有效的去除糖浆中的单糖和多糖,葡甘露低聚糖含量可达62.1%,分离效果较好,若进一步改变柱床高度,有望获得更好的分离效果。