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牡丹为我国传统名花和中药材,‘凤丹’(Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang var.lishizheniiB.A.Shen)主要用作药材和园艺砧木,抗逆性强适应性广,全国广为栽培;本世纪初拓展为新兴木本油料作物,成为集药用、观赏和油用于一体的大地绿化和牡丹籽油助推乡村振兴的抗逆优质树种。本论文基于该实验室1996年以来的‘凤丹’研究基础,建立‘凤丹’离体细胞培养体系,探究遗传改良亟需的植株再生体系和次生代谢物丹皮酚生产的细胞工程基础。主要结果如下。1.‘凤丹’无菌离体细胞培养体系建立优选‘凤丹’植株成熟饱满种子,去皮,以70%乙醇浸泡60 s,有效氯1.5%的二氯异氰尿酸钠水溶液浸泡30 min,接种在MS培养基上,去污染率高达98.89%;表面消毒的胚和试管苗叶片在6-BA 1.5 mg/L、2,4-D 2.0mg/L的MS培养基上,愈伤组织诱导率分别为90.00%和82.22%,试管苗茎段在6-BA 1.0 mg/L、2,4-D 2.0 mg/L的MS培养基上诱导率则为85.55%。2.离体细胞植株再生培养体系‘凤丹’愈伤组织接种在生长调节剂6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)和NAA(0.1、0.2、0.3 mg/L)各3个浓度组成的正交试验MS培养基上,生长调节剂对不定芽分化影响不显著(p>0.05),在 6-BA2.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L 或 6-BA 3.0 mg/L、NAA 0.3 mg/L的MS培养基上分化率最高,为13.33%。3.离体细胞丹皮酚积累培养体系‘凤丹’愈伤组织在固体培养基上培养,培养基类型、蔗糖、水解酪蛋白、琼脂浓度、pH值及培养时间对细胞增殖倍数有显著影响(p<0.05);愈伤组织褐化率与培养基类型、6-BA、蔗糖及琼脂浓度显著相关(p<0.05)。优化的细胞培养基为6-BA 1.8 mg/L、NAA 0.6 mg/L、蔗糖30 g/L、水解酪蛋白0.4 g/L、琼脂5g/L、pH 7.3的改良WPM(Wang and Staden,2001),暗培养,愈伤组织乳白色,呈S型曲线增长,10-30 d为对数生长期,30-45 d基本到达稳定期,35 d时的增殖倍数为3.67,褐化率为11.78%;每5d测定丹皮酚含量,25 d时的含量最高,达1.75±0.13 mg/g。‘凤丹’细胞悬浮培养,起始培养的细胞密度及6-BA、蔗糖、水解酪蛋白、肌醇浓度等对细胞增殖的鲜重、干重及增殖倍数有显著影响,而培养基类型对细胞干重影响显著(p<0.05)。优化的培养体系为:愈伤组织12 g/L(2 mm × 2 mm × 2 mm)及6-BA0.5 mg/L、NAA 1.0mg/L、蔗糖 25 g/L、肌醇 0.1 g/L,pH5.8的WPM培养基,震荡100 r/min,暗培养;悬浮细胞呈S型曲线增长,培养0-10 d为迟滞期,10-30 d为对数生长期,30-40 d基本到达稳定期;培养30 d时悬浮细胞增殖倍数达4.76,丹皮酚含量最高,达2.65±0.25 mg/g。