研究背景:肝细胞癌（简称肝癌）是威胁人类健康的全球性疾病。据报道仅有44%的肝癌病例在确诊时处于局限期,而其余的肝癌病例在确诊时已处于局部进展期或晚期。尽管肝癌早期筛查技术及根治性治疗措施已不断进步,但仍有约50%的肝癌患者需要接受系统治疗,尤其是在疾病晚期。作为系统治疗方法之一,靶向治疗是不可切除肝癌患者的重要治疗措施,其优势在于不仅可以延长患者生存期、改善患者生存质量,同时可以将部分不可切除肝癌转化为可切除肝癌。目前,肝癌的一线靶向治疗药物包括索拉非尼和仑伐替尼。然而,对一线靶向治疗药物耐药的肝癌患者越来越多,但是其耐药发生机制尚未明确,而且目前尚无有效策略逆转其耐药。鉴于目前一线靶向药物在肝癌治疗中的重要地位,以及肝癌患者应用一线靶向药物治疗后出现肿瘤进展的现实问题,本研究者主要设计了两部分实验,分别研究肝癌索拉非尼耐药机制及逆转耐药策略和肝癌仑伐替尼耐药机制及逆转耐药策略。第一部分SOX9介导肝癌索拉非尼耐药机制及其在肝癌患者预后中作用目的:通过构建肝癌索拉非尼耐药细胞系,模拟肝癌患者索拉非尼耐药,旨为探究肝癌索拉非尼耐药机制及逆转耐药策略提供新思路。与此同时,基于公共数据库探究性别决定区Y框9（Sex-determining region Y-box 9,SOX9）基因表达与肝癌患者预后的相关性,旨为寻找肝癌预后标志物。方法:1.通过长期逐渐增加索拉非尼药物浓度方法,诱导人肝癌细胞系HepG2发生索拉非尼耐药。2.实验技术:HepG2细胞及HepG2索拉非尼耐药细胞的转录组学测序及差异表达基因分析;应用sh RNA慢病毒载体使HepG2索拉非尼耐药细胞SOX9基因沉默并构建SOX9基因沉默的细胞株;应用RT-q PCR、蛋白免疫印迹及免疫荧光方法检测基因表达水平;应用细胞增殖实验与集落形成实验评估耐药细胞增殖能力及联合用药抑增殖效果;应用流式细胞术检测耐药细胞抗凋亡能力及联合用药促凋亡效果。3.公共数据库分析:基于Ualcan在线数据库（http://ualcan.path.uab.edu）分析SOX9 m RNA水平与肝癌临床病理因素之间的相关性,基于Kaplan-Meier Plotter在线数据库（https://kmplot.com/analysis）分析SOX9 m RNA水平与肝癌患者预后相关性,基于Pubmed及万方数据中临床研究进行荟萃分析探究SOX9蛋白水平与肝癌患者预后的相关性。结果:1.经过7个月时间成功建立HepG2索拉非尼耐药细胞系。原始细胞及耐药细胞转录组学测序的KEGG通路分析结果显示:索拉非尼耐药后存在转录调节异常,在所有升高的转录因子中SOX9改变倍数最大。2.进一步验证分析显示索拉非尼耐药细胞呈现SOX9表达升高,同时存在上皮间质转化、肿瘤细胞干性增强以及AKT/GSK-3β/β-catenin通路激活。对索拉非尼耐药株进行SOX9基因沉默,可逆转上皮间质转化、降低肿瘤细胞干性及下调AKT/GSK-3β/β-catenin通路活性,同时增加耐药细胞对索拉非尼的敏感性。3.NF-κB p65通过结合SOX9基因上游启动子促进SOX9转录,而应用NF-κB p65抑制剂（JSH-23）可以抑制SOX9表达、逆转上皮间质转化、降低肿瘤细胞干性及AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路活性;同时,JSH-23与索拉非尼联用可逆转索拉非尼耐药。4.公共数据库研究结果表明:与正常肝组织相比,肝癌组织SOX9 m RNA及蛋白水平表达升高,且SOX9高表达与肝癌患者整体生存期不良相关。结论:本研究表明SOX9与肝癌索拉非尼耐药密切相关,而SOX9高表达可能是通过促进上皮间质转化、增强肿瘤细胞干性以及激活AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路介导肝癌索拉非尼耐药。应用NF-κB p65抑制剂（JSH-23）可以逆转肝癌索拉非尼耐药,但SOX9特异性靶向抑制剂仍有待研发,进而精准地、高效地逆转肝癌索拉非尼耐药。此外,SOX9有望成为肝癌患者预后标志物之一。第二部分联用MDR1/BCRP泵抑制剂或EGFR/PI3K通路抑制剂逆转肝癌仑伐替尼耐药目的:通过构建肝癌仑伐替尼耐药细胞系,模拟肝癌患者仑伐替尼耐药,旨为探究肝癌仑伐替尼耐药新机制及逆转耐药策略提供新思路。方法:1.通过长期逐渐增加仑伐替尼药物浓度方法,诱导人肝癌细胞系Huh7发生仑伐替尼耐药。2.体外实验:Huh7细胞及Huh7仑伐替尼耐药细胞送转录组学测序,应用生物信息学方法分析差异功能基因;应用RT-q PCR、蛋白免疫印迹和免疫荧光方法进行基因表达水平检测;应用细胞增殖实验与集落形成实验评估耐药细胞增殖能力及联合用药抑增殖效果;应用流式细胞术检测耐药细胞抗凋亡能力及联合用药促凋亡效果;应用Chou-Talalay药物联合作用的定量方法,计算两种药物联合应用时的联合指数。3.体内实验:应用Huh7仑伐替尼耐药细胞在BALB/C裸鼠上建立仑伐替尼耐药模型,进一步评估联合用药方案体内抗肿瘤效果。结果:1.经过10个月时间成功建立Huh7仑伐替尼耐药细胞系。原始细胞及耐药细胞转录组学测序结果进行KEGG通路分析及进一步验证结果显示:肝癌仑伐替尼耐药后MDR1/BCRP转运体表达增高和EGFR/PI3K信号通路活性增强。2.应用依克立达通过抑制MDR1/BCRP转运体时可以增加细胞内仑伐替尼浓度,同时可以抑制肿瘤干细胞样特性（抑制集落形成能力,抑制肿瘤干性相关蛋白CD133、SOX9、C-Myc以及Ep CAM表达）。应用吉非替尼可抑制EGFR及其下游PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路活性,而应用库潘尼西可抑制PI3K/AKT信号通路活性,同时以上两种联合药物治疗策略均可以促进凋亡相关蛋白（Cleaved-Caspase3,Bax）生成。3.体外抗肿瘤效果分析:仑伐替尼联合MDR1/BCRP抑制剂（依克立达）或仑伐替尼联合EGFR/PI3K抑制剂（吉非替尼或库潘尼西）可协同抑制耐药细胞增殖,同时显著促进耐药细胞凋亡。4.体内抗肿瘤效果分析:（1）仑伐替尼可抑制细胞增殖及抗血管生成,耐药后停用仑伐替尼后肿瘤生长加速;（2）仑伐替尼与依克立达联用方案、仑伐替尼与吉非替尼联用方案均起到显著抗肿瘤作用,即抑制肿瘤生长以及抑制血管生成。结论:肝癌仑伐替尼耐药后MDR1/BCRP转运体表达增高和EGFR/PI3K信号通路活性增强,应用MDR1/BCRP转运体抑制剂或EGFR/PI3K通路抑制剂可逆转肝癌仑伐替尼耐药。然而,耐药后仑伐替尼仍有抑制细胞增殖及抗血管生成作用,而停用仑伐替尼会导致肿瘤生长加速;而仑伐替尼与上述靶向抑制剂联用,可显著抑制肿瘤生长。故肝癌仑伐替尼耐药以后,补救治疗方案可为仑伐替尼+新靶向抑制剂。综合上述两部分内容,本研究初步证实:（1）SOX9参与介导肝癌发生索拉非尼耐药,联用NF-κB p65抑制剂（JSH-23）间接抑制SOX9表达可逆转索拉非尼耐药;（2）MDR1/BCRP转运体表达增强以及EGFR/PI3K信号通路活化介导肝癌发生仑伐替尼耐药,联用MDR1/BCRP转运体抑制剂（依克立达）或EGFR/PI3K抑制剂（吉非替尼）可逆转仑伐替尼耐药。综上,本研究为肝癌患者一线靶向治疗药物耐药机制及逆转耐药策略提供了潜在的理论基础,为基础研究向临床转化提供理论依据。