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背景与目的肝癌早期容易发生血行转移。研究表明,跨内皮迁移(TEM)是癌细胞血行转移的必要步骤【1】。并非所有癌细胞都具有恶性特征,肿瘤干细胞才是肿瘤转移复发的源头,CD133是重要的肝癌干细胞标记物,肿瘤微环境中趋化因子对肿瘤干细胞转移有非常重要调控作用【2,3】。既往研究表明,乙肝相关性HCC患者体内趋化因子Mig高表达,有转移者其受体CXCR3亦高表达;同时,Mig刺激后通过TEM的CD133+细胞数量较无Mig刺激时明显增多,提示Mig在CD133+细胞TEM过程中扮演着非常重要的角色。但其分子机制仍不清楚。本项目拟探讨Mig/CXCR3在CD133+肝癌细胞跨内皮屏障迁移中的作用及其分子机制,为肝癌细胞早期转移寻找潜在的干预靶点。方法(1)对常见的肝癌细胞系进行流式表型分析,测定各个细胞系中CD133分子的表达情况,来选取合适的细胞系进行肿瘤干细胞的分选。(2)利用胶原酶灌注法提取原代脐静脉内皮细胞,通过测定细胞表面特定标记物加以鉴定。(3)检测经Mig刺激原代脐静脉内皮细胞后采用激光共聚焦观察内皮细胞骨架蛋白Actin的定位和结构变化;免疫组化法检测通讯连接蛋白Cx32表达,并用实时定量PCR及Western blot检测各组内皮细胞的通讯连接蛋白CX32 m RNA及蛋白水平变化;(4)检测经Mig处理内皮细胞后实时定量PCR及Western blot检测各组内皮细胞中粘附分子VE-cadherin m RNA及蛋白水平变化;(5)采用cck8法检测经Mig刺激内皮细胞后的内皮细胞增殖活性;(6)Western blot方法检测Mig处理内皮细胞后下游信号分子的变化;(7)CD133+肝癌细胞及血管内皮细胞共培养,采用Transwell培养系统模拟单层内皮屏障,研究Mig处理在促CD133+肝癌细胞跨内皮屏障迁移中对肝癌细胞的运动、侵袭、粘附等能力的变化;(8)CD133+肝癌细胞及原代脐静脉内皮细胞共培养后,探索Mig/CXCR3对内皮迁移的作用及小管形成能力。结果(1)通过流式分选常见肝癌细胞系CD133分子表达情况,选择Hep-3B和PLC细胞系用来分选CD133+肿瘤干细胞。(2)提取的原代脐静脉内皮细胞通过激光共聚焦扫描FⅧ分子来进一步验证提取的细胞是脐静脉内皮细胞。(3)用Mig刺激原代脐静脉内皮细胞后激光共聚焦扫描看到骨架蛋白F-actin边集,分别利用RT-PCR和Western Blotting观察Mig+和Mig-组内皮细胞间缝隙连接蛋白Cx32的表达,结果发现Mig+内皮细胞Cx32表达明显下降(P<0.05)。(4)用Mig刺激原代脐静脉内皮细胞后采用RT-PCR和Western Blotting观察Mig+和Mig-组内皮细胞间粘附分子VE-cadherin的表达,结果发现Mig+内皮细胞VE-cadherin表达明显下降(P<0.05)。(5)用Mig刺激原代脐静脉内皮细胞后采用CCK8法观察Mig+和Mig-组内皮细胞增殖活性,结果发现Mig+内皮细胞增殖活性明显下降(P<0.05)。(6)采用Transwell共培养小室培养原代脐静脉内皮细胞及CD133+肝癌细胞后,通过Transwell实验、粘附实验检测CD133+肝癌细胞与Mig-和Mig+组内皮细胞共培养后迁移、侵袭、粘附能力的改变,结果观察到与Mig+内皮细胞共培养的CD133+肝癌细胞的迁移、侵袭、粘附能力增强(P<0.05)。(7)采用Transwell共培养小室培养原代脐静脉内皮细胞及CD133+肝癌细胞后,通过RT-PCR观察与CD133+肝癌细胞共培养的Mig+和Mig-组内皮细胞间缝隙连接蛋白Cx32的表达,结果发现Mig+内皮细胞Cx32表达明显下降,同时发现Mig+内皮细胞小管形成能力强于Mig-组(P<0.05)。结论(1)Mig/CXCR3可促使内皮细胞缝隙连接细胞间通讯破坏,通讯连接蛋白Cx32表达明显减低,促使骨架蛋白Actin结构改变并发生边集;(2)Mig/CXCR3可使内皮细胞间粘附分子VE-cadherin表达水平明显降低,并且明显抑制内皮细胞的增殖;(3)Mig/CXCR3可促进CD133+肝癌细胞跨内皮细胞屏障的迁移,Mig与CXCR3结合后肝癌细胞运动迁移能力增强;(4)Mig/CXCR3增强与CD133+肝癌细胞共同培养的内皮细胞小管形成能力。