论文部分内容阅读
目的:西妥昔单抗(cetuximab)抗EGFR的治疗已经被推荐作为晚期结直肠癌KRAS基因野生型患者的一线治疗方案,而KRAS突变型患者对其治疗耐药。BRAF突变状态也可以作为EGFR抑制剂治疗的预测指标,突变型患者治疗反应较差。为了使更多患者从西妥昔单抗靶向治疗中获益,迫切需要解决西妥昔单抗耐药及提高疗效的方法。目前,许多研究发现辛伐他汀(simvastatin)具有抗肿瘤作用。因此,本实验旨在研究辛伐他汀能否逆转KRAS基因突变所致的西妥昔单抗耐药及提高BRAF基因突变者使用西妥昔单抗的有效率,并探讨其具体分子机制。方法:本研究选取含有KRAS基因突变型的DLD-1、LOVO细胞系及BRAF基因突变型的RKO、HT-29细胞系作为研究对象,经过正常培养基、西妥昔单抗单药、辛伐他汀单药、西妥昔单抗及辛伐他汀两药联合处理后,主要通过MTT法、AnnexinV/PI双染法、Western blot法检测辛伐他汀在体外克服结肠癌细胞对西妥昔单抗的耐药、提高疗效及具体分子机制。结果:1.辛伐他汀联合西妥昔单抗处理KRAS基因突变型的人结肠癌DLD-1细胞系,可以提高其对西妥昔单抗的敏感性。然而,辛伐他汀与西妥昔单抗联合处理对BRAF基因突变型的人结肠癌RKO细胞系无作用。对于DLD-1细胞系,cetuximab单药处理组较simvastatin联合cetuximab处理组细胞增殖率由0.8821±0.0041减少至0.6987±0.0054,受到明显抑制(P<0.001);LOVO细胞系两组细胞增殖率由0.9065±0.0074减少至0.7198±0.0069,受到明显抑制(P<0.001);而对于RKO细胞系,cetuximab单药组及simvastatin联合cetuximab处理组的细胞增殖率分别为1.039±0.0561及1.013±0.0491,无抑制作用(P>0.05),HT-29细胞系的两组细胞增殖率分别为 0.8742±0.0057 及 0.8585±0.0058,无抑制作用(P>0.05)。2.simvastatin联合cetuximab处理可以促进DLD-1细胞凋亡(P<0.05),流式细胞仪检测显示联合加药组相对于cetuximab单药组的总凋亡细胞比例从9.59%增加至28.22%。而对于RKO细胞系,联合加药对细胞凋亡无促进作用(P>0.05),结果显示总凋亡细胞比例相对于单药组无明显增多,分别为5.54%和7.49%。相关凋亡蛋白表达结果显示对于DLD-1细胞系,simvastatin联合cetuximab处理组相较与cetuximab单药组,抗凋亡蛋白Bcl-xl表达下降,凋亡前蛋白Bad表达升高。而RKO细胞系经simvastatin联合cetuximab处理较cetuximab单药处理,Bcl-xl及Bad表达无明显变化。3.对于DLD-1细胞系,simvastatin不同浓度处理后,BRAF及p-ERK1/2的表达逐渐降低,并且作用浓度越高,BRAF及p-ERK1/2的表达越低,具有浓度依赖性;simvastatin不同作用时间处理后,BRAF及p-ERK1/2的表达逐渐降低,并且作用时间越长,BRAF及p-ERK1/2的表达越低,具有时间依赖性,RAS/RAF/MEK/ERK通路的激活受到抑制。然而对于RKO细胞系,经不同浓度或不同时间simvastatin处理后,BRAF及p-ERK1/2的表达无明显变化。结论:1.辛伐他汀可有效地提高KRAS基因突变所致对西妥昔单抗耐药人结肠癌细胞对西妥昔单抗的敏感性,抑制细胞增殖;2.辛伐他汀可促进KRAS基因突变所致对西妥昔单抗耐药的人结肠癌细胞凋亡,下调抗凋亡蛋白Bcl-xl表达,上调凋亡前蛋白Bad表达;3.辛伐他汀克服西妥昔单抗耐药的作用机制可能是抑制了RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的激活。