第一部分microRNA-218的表达及对胃肠道间质瘤细胞生物学行为的影响及其作用背景：胃肠道间质瘤(gastrointestinal stormal tumor, GIST)起源于胃肠道的间质细胞-cajal细胞(interstitial cell of cajal，ICC)，是人类胃肠道最常见的间叶性肿瘤，主要发生于胃和小肠。胃肠道间质瘤好发于老年患者。全球发病率每年每百万人口11-19.6例。美国每年新发病例数介于3300和6000之间。手术切除后，间质瘤常表现为局部复发、在腹部浆膜表面扩散弥漫或转移至肝脏甚至于更远处的器官或组织，包括肺和骨等。胃肠道间质瘤细胞外形多样，可表现为梭形样细胞或上皮样的细胞，并大多表现对于KIT（CD117）和/或DOG1的免疫阳性。在靶向治疗药物问世之前，进展期胃肠道间质瘤患者由于对化疗和放疗不敏感，因此预后较差。本研究主要检测microRNA-218(miR-218)在人胃肠道间质瘤组织和细胞中的表达情况和对胃肠道间质瘤细胞GIST-T1生物学特性的影响，为胃肠道间质瘤治疗提供新方法和新策略。方法：利用定量实时PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测miR-218在胃肠道间质瘤组织和病灶旁组织，以及各胃肠道间质瘤细胞系(GIST882、GIST430、GIST48和GIST-T1)中的表达情况。在GIST-T1细胞中转染miR-218mimic后48h，qRT-PCR检测GIST-T1细胞中miR-218表达变化； MTT检测miR-218对胃肠道间质瘤细胞GIST-T1细胞活力的影响。流式细胞仪分析miR-218对GIST-T1细胞增殖、凋亡的影响。采用transwell侵袭小室检测miR-218对GIST-T1细胞迁移的影响。结果： qRT-PCR检测结果显示：与瘤旁组织相比，miR-218在胃肠道间质瘤组织和胃肠道间质瘤细胞系中的表达显著下降(p<0.0001)。与对照组相比，在GIST-T1中转染miR-218mimic48h后，细胞中miR-218的表达显著上升(p<0.01)。MTT结果显示：在GIST-T1细胞中过表达miR-218后，细胞活力显著下降(p<0.01)。流式细胞仪分析结果显示：过表达miR-218后，细胞的增殖指数明显下降(p<0.01)；细胞的凋亡显著增加(p<0.01)。transwell侵袭小室检测结果显示：增强miR-218的表达后，穿过transwell小室的细胞数显著降低(p<0.01)。结论：miR-218在人胃肠道间质瘤组织和细胞系的表达下调，并抑制胃肠道间质瘤细胞增殖和侵袭。增强miR-218表达的治疗策略有望使胃肠道间质瘤患者受益。第二部分microRNA-218的靶基因及其调控机制的研究背景：microRNAs（miRNA）的是内源性非编码小RNA，长度约22个核苷酸(nucleotide，nt)，通过对转录和/或翻译的影响调节靶基因的表达。microRNAs在正常生理发育以及在病理状态(包括癌症)中发挥着作用。许多癌细胞显示microRNAs的异常表达，这异常表达在癌症的发生和发展过程中发挥重要作用。预测超过有1/3的人类基因都是保守的miRNA的靶基因。因此，miRNA在人类疾病尤其是肿瘤中所起到的作用越来越受到人们的关注。前一部分研究已探讨了miR-218的表达，以及miR-218对胃肠道间质瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭的影响。本部分研究主要探索miR-218通过调控靶基因对胃肠道间质瘤细胞生物学行为的作用。方法：通过在线软件TargetScan预测KIT为miR-218的调控靶基因之一。构建荧光素酶质粒：化学合成包含有与相应miR-218互补结合的靶基因KIT3’-UTR序列片段和突变的KIT3’-UTR序列片段，将包含预测miR-218结合位点的KIT3’-UTR和突变的KIT3’-UTR(mutant)的片段克隆进pGL3-Luciferase载体的XbaⅠ位点。共转染包含KIT3’-UTR的荧光素酶质粒，以及miR-218mimic或non-specific control。同时设正常对照组。转染48小时后收集细胞并使用荧光素酶试剂盒检测，酶标仪读数。采用Westernblot法测定miR-218对KIT蛋白表达的影响。结果：荧光素酶报告基因系统检测结果显示：与对照组相比，转染miR-218mimic组的相对荧光素酶活力显著降低(p<0.01)。Western blot检测结果显示：与对照组相比，在GIST-T1中转染miR-218mimic48h后，细胞中KIT蛋白的表达显著下降(p<0.01)。结论：KIT是miR-218作用的靶基因，miR-218可负性调节KIT蛋白的表达。第三部分microRNA-218通过PI3K/Akt通路促进胃肠道间质瘤细胞对伊马替尼的敏感性背景：胃肠道间质瘤发生于胃肠道肌层。酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），如伊马替尼和舒尼替尼，可阻断KIT的异常活化，具有持久控制疾病的临床优点。当胃肠道间质瘤手术无法治愈时，伊马替尼则成为标准一线治疗本病方案。伊马替尼抑制KIT蛋白是翻译后抑制，通过竞争性结合KIT蛋白的ATP结合位点起作用。然而，伊马替尼对KIT抑制并不完美，在治疗过程中如发生特定氨基酸序列的突变，抑制了伊马替尼结合KIT的ATP结合位点会导致伊马替尼的耐药。伊马替尼并不能治愈晚期胃肠道间质瘤。此外，虽然大部分的伊马替尼治疗的患者没有表现出原发耐药（治疗前六个月内病情恶化）的迹象，至少有一半的患者在两年的治疗后，经过七年甚至超过80％的患者，出现对伊马替尼继发耐药。本部分研究主要检测microRNA-218(miR-218)在甲磺酸伊马替尼敏感人胃肠道间质瘤细胞(GIST882)和甲磺酸伊马替尼耐药细胞株(GIST430)中的表达情况，探讨miR-218与胃肠道间质瘤细胞对甲磺酸伊马替尼化疗敏感性的关系和作用信号通路，为胃肠道间质瘤治疗提供新方法和新策略。方法：分别体外培养人胃肠道间质瘤细胞系：GIST882和GIST430，利用定量实时PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测miR-218在两种胃肠道间质瘤细胞中的表达情况。在胃肠道间质瘤细胞GIST882和GIST430中转染miR-218mimic或miR-218inhibitor后48h，qRT-PCR检测转染后细胞中miR-218表达变化；MTT检测在GIST882或GIST430细胞中的miR-218异位表达对甲磺酸伊马替尼诱导的胃肠道间质瘤细胞细胞活力的影响。采用Annexin V/PI双染法，流式细胞仪分析miR-218的异位表达对甲磺酸伊马替尼诱导的胃肠道间质瘤细胞凋亡的影响。采用PI3K通路抑制剂Wortmannin、Western blot方法和流式细胞仪检测miR-218异位表达对甲磺酸伊马替尼诱导的胃肠道间质瘤细胞中AKT和p-AKT表达和凋亡的影响。结果：qRT-PCR检测结果显示： miR-218在甲磺酸伊马替尼耐药细胞株(GIST430)中的表达明显低于甲磺酸伊马替尼敏感人胃肠道间质瘤细胞(GIST882)(p<0.01)。与对照组相比，在GIST430细胞中转染miR-218mimic48h后，细胞中miR-218的表达显著上升(p<0.01)，转染miR-218inhibitor后，miR-218的表达明显下降(p<0.01)。与对照组相比，在GIST882细胞中转染miR-218mimic48h后，细胞中miR-218的表达显著上升(p<0.01)，转染miR-218inhibitor后，miR-218的表达明显下降(p<0.01)。MTT和流式细胞仪检测结果显示：在甲磺酸伊马替尼作用下的GIST882细胞中抑制miR-218表达后，细胞活力明显上升(p<0.01)，细胞凋亡数明显减少(p<0.05)；而在甲磺酸伊马替尼作用下的GIST430细胞中miR-218过表达后，细胞活力明显下降(p<0.01)，细胞凋亡数明显增加(p<0.05)。Western blot和流式细胞仪检测结果显示：与对照组相比，过表达miR-218可明显抑制GIST430细胞中p-AKT表达(p<0.01)；促进细胞凋亡(p<0.01)。结论：miR-218在甲磺酸伊马替尼耐药胃肠道间质瘤细胞株(GIST430)中表达下调，过表达miR-218可促进胃肠道间质瘤细胞对甲磺酸伊马替尼的敏感性，其作用可能通过PI3K/Akt信号通路。