气体信号分子是一种生物体内源性产生的传递细胞信号的小分子气体,其灵活性与特殊性使这类信号分子在生物体中具有不可替代的生理功能。目前已明确的气体信号分子包括一氧化氮（Nitric oxide,NO）、一氧化碳（Carbon monoxide,CO）和硫化氢（Hydrogen sulfide,H₂S）,而三者中H₂S最晚被发现具有气体信号分子的功能。在哺乳动物中,H₂S参与促进血管舒张、改善心脏衰竭、调节神经系统功能等多种生理过程,其信号作用及产生机制已被充分证实。而植物中关于H₂S信号功能的研究开展较晚,其深层次的机制研究仍然十分有限。有报道表明,外源H₂S能够增强植物对重金属胁迫（Heavy metals,HMs）的抗性,减少毒害离子在植物体内的积累,但是植物对胁迫环境下内源H₂S产生的调控以及H₂S起保护作用的信号转导机制还未见深入报道。近年来,随着工业“三废”的排放以及化肥农药的大量施用,我国土壤HMs污染日益严重。耕地HMs污染不仅影响作物的生长发育,造成农产品产量和品质下降,还能通过食物链危害人类健康,因此加强植物应答HMs胁迫机制的研究势在必行。充分理解内源H₂S对HMs的响应模式以及H₂S增强植物HMs耐受性的作用机制,可以为培育高产安全的作物品种提供新思路,为最大程度地降低耕地HMs污染造成的农业经济损失提供科学依据。本论文主要研究气体信号分子H₂S与钙信号在植物抵御Cr⁶⁺胁迫过程中的互作机制,重点探讨Ca²⁺/CaM2对H₂S产生酶编码基因LCD的转录调控,首次提出胁迫环境下植物激活内源H₂S产生的信号途径,并简要分析了H₂S-Cys循环系统对Cr⁶⁺胁迫的响应模式,为深入理解H₂S信号提供理论依据。主要研究结果如下:1.Cr⁶⁺胁迫通过上调H₂S产生酶编码基因（LCD、DCD1、DCD2、DES1）的表达促进谷子（Setaria italica）内源H₂S的产生。生理浓度外源H₂S能降低胁迫过程中H₂O₂的积累,缓解Cr⁶⁺胁迫引起的氧化损伤以及根尖细胞死亡,增强谷子对Cr⁶⁺胁迫的抗性,H₂S合成抑制剂HA处理加重Cr⁶⁺胁迫的毒害效应,该结果证明H₂S参与谷子响应Cr⁶⁺胁迫,并且在谷子抵御Cr⁶⁺胁迫过程中具有重要作用。2.Cr⁶⁺胁迫对谷子H₂S产率的诱导效应被Ca²⁺加强,被Ca²⁺螯合剂EGTA削弱。进一步研究发现,Cr⁶⁺胁迫诱导胞内Ca²⁺浓度升高,激活钙信号,增强H₂S产生相关基因的表达,促进内源H₂S产生,而H₂S进一步影响CaM和CBL的表达参与钙信号共同完成抗性的诱导。该结果表明Ca²⁺参与Cr⁶⁺胁迫介导的内源H₂S产生的增加,H₂S和钙信号以复杂的交叉互作共同参与谷子抵御Cr⁶⁺胁迫。3.H₂S和Ca²⁺通过复杂的互作调控HMs转运相关基因的表达,控制Cr⁶⁺的吸收和转运,促进Cr⁶⁺的排出和区室化,减少有毒离子在谷子体内的积累;Ca²⁺以H₂S依赖的方式增强MT3A和PCS1的表达,促进MTs和PCs的积累对Cr⁶⁺进行螯合解毒;H₂S促进抗氧化分子GSH和AsA的积累缓解Cr⁶⁺胁迫引起的氧化损伤,Ca²⁺提高抗氧化酶SOD和POD的活性,并且以H₂S依赖或不依赖的方式提高GSH和AsA的含量,维持氧化还原的平衡。综上,H₂S和Ca²⁺通过复杂的交叉互作协同调控金属离子转运系统、抗氧化系统以及HMs螯合系统提高谷子对Cr⁶⁺胁迫的抗性。4.为深入探究Ca²⁺促进Cr⁶⁺胁迫下内源H₂S产生的作用机制,以模式生物拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚野生型（Col-1,WT）和H₂S产生缺陷突变体lcd（SALK₀82099）为实验材料,研究钙信号对H₂S产生的调控。Cr⁶⁺胁迫诱导的LCD基因的上调表达以及内源H₂S含量的升高被Ca²⁺显著加强,而EGTA预处理明显抑制Cr⁶⁺对LCD基因及内源H₂S含量的促进作用。在lcd突变体中,Ca²⁺对Cr⁶⁺胁迫下H₂S产生的促进作用被显著降低,说明Cr⁶⁺胁迫以Ca²⁺依赖的方式增强LCD的转录,促进内源H₂S的产生。5.体内体外分子生物学实验表明,CaM2介导的钙信号参与Cr⁶⁺胁迫对LCD的转录调控,Cr⁶⁺胁迫提高CaM2的转录和翻译水平,促进Ca²⁺/CaM2与转录因子TGA3的互作,进而增强TGA3与LCD启动子“TGACG”顺式作用元件的结合,上调LCD的基因表达,增加Cr⁶⁺胁迫下内源H₂S的释放。6.以CaM2或TGA3的功能缺失突变体cam2和tga3以及双突变体cam2/lcd和tga3/lcd为实验材料的遗传学实验证据表明,Cr⁶⁺胁迫不能诱导突变体中内源H₂S含量的升高。与WT相比,单突变体和双突变体均对Cr⁶⁺胁迫表现出更高的敏感性,说明Ca²⁺/CaM2-TGA3介导的LCD基因表达调控以及内源H₂S含量的增加在拟南芥抵御Cr⁶⁺胁迫过程中具有重要作用。7.以拟南芥WT（Col-0）、H₂S产生缺陷突变体lcd和des1以及过表达突变体OE-LCD和OE-DES1为实验材料,探讨H₂S-Cys循环系统对Cr⁶⁺胁迫的响应模式。Cr⁶⁺胁迫不同程度地增加内源H₂S和Cys的含量,并且Cr⁶⁺胁迫诱导内源H₂S含量的升高先于Cys含量的变化,进一步研究发现生理浓度外源H₂S通过上调SAT1和SAT5的基因表达,促进SAT介导的中间产物OAS的产生,最终诱导Cr⁶⁺胁迫下的Cys积累。Cr⁶⁺胁迫诱导的H₂S产生消耗掉的Cys仅占Cr⁶⁺胁迫下Cys含量的7.5%,即产生H₂S消耗的Cys不足以影响Cr⁶⁺胁迫诱导的大量Cys积累。8.H₂S-Cys信号协同增强GSH的产生,GSH一方面作为抗氧化剂抵御Cr⁶⁺胁迫引起的氧化胁迫,另一方面作为前体促进植物HMs螯合剂的合成,对毒害离子进行螯合解毒;H₂S和Cys以不同方式、不同侧重点促进HMs螯合剂PCs和MTs的积累,提高拟南芥对Cr⁶⁺胁迫的抗性。综上,本研究发现Ca²⁺可以促进Cr⁶⁺胁迫下谷子内源H₂S的产生,增强其对Cr⁶⁺胁迫的抗性。进一步以模式植物拟南芥为材料探究Ca²⁺介导的钙信号促进内源H₂S产生的分子机制。利用实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫共沉淀、凝胶阻滞、染色质免疫共沉淀、烟草叶片瞬时表达体系等分子生物学实验,证明Cr⁶⁺胁迫提高植物体内CaM2的转录和翻译水平,促进Ca²⁺/CaM2与bZIP转录因子TGA3的结合,增强TGA3与LCD启动子的结合,上调LCD的基因表达,促进内源H₂S的产生,而H₂S调节Ca²⁺下游相关基因的表达,两者相互作用共同完成Cr⁶⁺抗性的诱导。一方面,H₂S和Ca²⁺通过复杂的交叉互作协同调控抗氧化系统、金属离子转运系统以及HMs螯合系统参与谷子抵御Cr⁶⁺胁迫;另一方面,H₂S作为信号分子上调Cys合成基因的表达,促进Cys积累,增加GSH的合成,同时H₂S和Cys促进HMs螯合剂PCs和MTs的积累,提高拟南芥对Cr⁶⁺胁迫的抗性。本文首次提出Cr⁶⁺胁迫下植物激活内源H₂S产生的信号途径,为深入理解H₂S在植物抵御HMs胁迫过程中的信号功能提供更清晰的证据。