溶酶体可以通过发生溶酶体膜通透(lysosomal membrane permeabilization，LMP)、释放内含的水解酶而介导细胞凋亡。本实验室首次发现，胰凝乳蛋白酶不仅是一种消化酶，还存在于多种细胞的溶酶体中;在不同的细胞凋亡刺激因素的作用下，LMP的发生可使胰凝乳蛋白酶释放入胞浆，并剪切Bid、钙调神经磷酸酶等底物，继而通过线粒体途径诱导细胞凋亡。此外，溶酶体胰凝乳蛋白酶还参与细胞自噬。溶酶体的功能缺失导致细胞凋亡及细胞自噬的异常，并与多种疾病的发生发展密切相关，这些疾病包括溶酶体蓄积症、早老性痴呆、癌症和非酒精性脂肪肝等。非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是目前最普遍的一种肝脏慢性疾病，其病情发展过程伴随肝细胞损伤及死亡，但其分子机制仍不清楚。鉴于溶酶体与NAFLD的密切关系，从本实验室已有的研究基础出发，本课题通过研究溶酶体介导的细胞凋亡和细胞自噬在NAFLD疾病模型中对肝细胞命运的作用，同时研究胰凝乳蛋白酶是否参与介导病理条件的细胞死亡，为进一步阐明NAFLD的发病机制，并为预防、治疗这一重大疾病提供新思路。　　 首先，本论文通过油酸和棕榈酸等游离脂肪酸处理肝细胞，建立了NAFLD细胞模型。发现肝细胞蓄积过量脂质后，活性氧水平明显增高，对过氧化氢所致的细胞凋亡更加敏感，而经抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸预处理的脂质蓄积肝细胞其存活率明显升高，提示氧化应激在NAFLD发病过程中起重要作用。与正常肝细胞相比，蓄积了过量脂质的肝细胞在过氧化氢等促凋亡因素的作用下更易发生LMP，导致胰凝乳蛋白酶更易扩散进入胞浆;而抑制胰凝乳蛋白酶的活性可显著抑制细胞凋亡，说明溶酶体内含的胰凝乳蛋白酶是介导NAFLD病理条件下细胞凋亡的关键分子。　　 鉴于溶酶体与NAFLD的模型细胞凋亡的密切关系，本论文对肝细胞脂质蓄积后溶酶体的脂质组成及重要蛋白酶表达水平的改变进行了初步研究。通过高脂饲料饲养小鼠，构建肝脏脂质蓄积动物模型，并对分离纯化的肝细胞溶酶体脂质及蛋白酶进行定性分析，发现肝细胞发生脂质蓄积后，溶酶体膜中磷脂酸(phosphatidic acid, PA)的含量增加，溶酶体内含的胰凝乳蛋白酶等多种蛋白水解酶的表达水平也明显增高;PA的含量增加可能与磷脂酶D1表达水平增加有关。本实验室前期工作已经证明，PA是介导凋亡细胞溶酶体膜通透的关键脂质分子，因此在NAFLD病理条件下溶酶体易发生LMP、细胞易发生细胞凋亡可能与溶酶体膜PA含量的增加及溶酶体内胰凝乳蛋白酶等细胞凋亡相关蛋白酶表达水平的增加相关。　　 在此基础上，又由于溶酶体的功能与细胞自噬有关，而自噬也与细胞凋亡相关，因此，进一步研究了本论文在NAFLD细胞自噬与细胞凋亡的关系。肝细胞发生脂质蓄积后，细胞自噬水平明显升高，而抑制脂质蓄积细胞的自噬后显著促进细胞内的脂质蓄积，并增加细胞对凋亡刺激因素的敏感性，提示自噬是细胞应对脂质过载的保护性应激措施。用过氧化氢处理细胞可以明显抑制自噬流，从而解除自噬对细胞的保护作用。进一步对细胞自噬起始阶段及膜融合阶段重要信号分子的动态变化进行了系统分析，发现肝细胞经过氧化氢处理后，AMPK-ULK1激酶级联通路发生了快速激活，提示氧化应激促进了自噬的起始;但氧化应激同时还改变了细胞内微管的结构，抑制自噬体与溶酶体的融合，最终阻断自噬流。过氧化氢对细胞自噬的抑制效应可能是NAFLD病理条件下肝细胞更易发生细胞凋亡的重要因素之一。　　 综上所述，在NAFLD细胞模型中，氧化应激抑制自噬的发生，从而促进了脂质在肝细胞中的过量蓄积，继而上调磷脂酶D1表达，引起溶酶体膜PA含量增高;而PA是介导细胞凋亡过程中溶酶体膜通透的关键磷脂分子，溶酶体膜PA含量增加敏化了溶酶体对氧化应激等促凋亡因素的相应，使NAFLD病理条件下的肝细胞更易发生LMP，继而通过依赖于溶酶体-线粒体的凋亡通路启动细胞凋亡。我们还发现胰凝乳蛋白酶是介导NAFLD模型细胞发生凋亡的关键蛋白酶。以上结果提示，溶酶体在NAFLD病理条件下的细胞死亡中起着重要作用，这为NAFLD的预防及治疗提供了新策略和新靶点。