背景：肥厚型心肌病是一种原发性的心肌病，以心室肥厚和肌纤维排列紊乱为特点。家族性肥厚型心肌病以常染色体显性方式遗传。国外报告患病率约为0.2％。江苏省人民医院心血管流行病研究室在1985-1994年间对60岁以下人群进行研究，报告年平均发病率为1.3-1.5／10万。患者临床表现变异较大，可无症状亦可出现严重心律失常、心力衰竭甚至猝死。肥厚型心肌病是健康个体最主要的猝死原因之一。研究肥厚型心肌病病因，发病机制具有重要的临床意义：1．可以更好的定义和诊断该疾病；2．增加对该病病理生理的认识；3．对该病和左心室肥厚(LVH)分子基础的阐明起关键作用；4．可以在出现临床症状前得到诊断及遗传咨询；5．对患者进行危险度分层；6．为探讨新的治疗方法提供理论依据，防止该病在儿童时期的进展或促使该病在成年人中消退。目前已知至少有11种编码肌小节蛋白的基因约近200种突变与肥厚型心肌病有关，即：β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain，β-MyHC)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、心肌肌钙蛋白C(cardiac troponin C，cTnC)、肌球蛋白结合蛋白C(myosin binding protein C，MyBP-C)、肌联蛋白(titin)、肌球蛋白必需轻链和调节轻链(myosin essential and regulatory light chains)、α-肌动蛋白(alpha-actin)、α-原肌球蛋白(alpha-tropomyosin，α-TM)、α-肌球蛋白重链(alpha-myosin heavy chain，α-MyHC)。其中约15-20％的肥厚型心肌病患者由心肌肌钙蛋白I、T基因突变引起。目前肥厚型心肌病的病因研究进展很快，但对发病机制的研究相对滞后。 目的：研究肥厚型心肌病与心肌肌钙蛋白I、T基因突变的关系，尝试用多种实验方法检测突变；克隆SD大鼠心肌肌钙蛋白I基因，构建一种肥厚型心肌病相关心肌肌钙蛋白I基因突变类型(Lys184缺失突变，相当于人Lys183)重组腺病毒载体，用于发病机制的研究。内容与方法：1．收集临床确诊的肥厚型心肌病病例58例，提取外周血白细胞 DNA。二．叮R扩增心 肌肌钙蛋白I基因7、8号外显子，产物直接坝序检 测有无突变。3．KR扩增。G肌肌专蛋白T基因8、9、n号外显子及。G肌肌钙蛋 白1基因5 号外显子，采用单链构型多态性（single七trand COflfoflfltloflPolymorphism，SSCP）分析法检坝哭变。一．对新发现的突变设计相应的生物素标记寡核苦酸探针，斑点杂 交进一步验证结果。5．RT－PCR法克隆洲 大鼠心3几j几钙蛋白 ICDNA，同时在 CDNA两端 弓入 A fi 11 ／N h elF 制性酶切位点。6．采用定点哭灭枝术卜ite个irectedmutagenesis）构建。U肌肌 钙蛋白ILyS184缺夫突变CDNA，并做测序验证。7．KR方法在突变及野生型的 心删几钙蛋白IC洲AC端引入6X HIS标签序歹。8．牙用A＊11 ＊he双酶切将 突变及野生勺C月肌钙蛋白Ic ＊A 亚克隆至穿梭质粒。9．P工Scel／I｛ed双酶切重组穿梭质粒，分别将含有突变及野生 的酶切片段亚克隆到腺病毒载体。10．Pac酶切重组腺病毒DNA，转染HEK2”细胞。扩增收集重组 腺病毒，分另IJ用KR和 wes tern彦迹法鉴定构建的 cDNA和目的 蛋白表达。11．C S CI梯度超速昏 法纯｛t重组腺病毒。12．开胸暴露SD大鼠，G脏，直接在心肌内注射腺病毒，2周后注射 ％F位。＊肌做免疫组化 检坝及 we。t。r n6迹分析。结果：1．肥厚型。。肌病患者58例；其中有家族史2一例，散发性病例N 仔入男36 ｛F入女22例，年龄1卜77岁（平均46．“上17．％岁）。 病程 0刁6年；平均病程 5．57 t 5．40年；发病年龄 5刁6岁；平 士发病年龄叩．48 t侣．22岁。58例病人中2例（3．州）无特 6 殊不适；胸痛、胸闷41例（70．批），。G悸20例（34．5％），晕 厥10例门7．2们，呼吸困难11例门9．0％）；超声』C动图表现： 梗阻型19仑11（u．8％），非梗阻型”例门7．2％），。C尖肥厚型 5 ｛FIJ门．6们；4 0例具有完整的。。电图资料，其中 31例有 S T｛ 改变（77．5％），8例出现异常Q波（2＊．0％）。2．在1仟州巴厚型。删几病病人发现新的心肌肌钙蛋白I基因突变类 型：Arg R14打r卜 100例正常对照人群中未发现该突变类型。3．未发现目前国外已报道的所有。G肌肌钙蛋白I基因突变类型。4．生物素标记的寡核酸探针杂交证实新发现的。。肌肌钙蛋白I基 因突变Arg R145Trp。5，队R扩增。卯几肌钙蛋白I基因S号外显子，产物％n分析未见 异常。6．nR扩增，G肌肌钙蛋白T基因8号、9号和甘 号外显子，产物 SSCP分析未见异常。7．jNIJ序证实获得两端带 Af 11州hC限制性酶切位点的汕大鼠 。H月JLR］L姜 蛋白IcDNA 克隆。8．jNIJ序证实经PCR定点突变技术获得。HjL肌钙蛋白 ILysl84缺失 突变CDNA。在突变及野生CDNA C多 弓入6 X