第一部分绝经后骨质疏松症患者破骨前体细胞microRNA表达谱改变目的：分离纯化绝经后骨质疏松症患者和绝经后骨量正常妇女的CD14+外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs),研究绝经后骨质疏松症患者PBMCs microRNA表达谱的变化。方法：招募相互匹配的51例绝经后中国女性,其中26人确诊为绝经后骨质疏松症,25例骨量正常。从上述相互匹配的两组人群中各随机抽取5名对象,以密度梯度离心法分离外周血单核细胞,用免疫磁珠法分选出高纯度的CD14+外周血单核细胞(PBMCs);应用microRNA微阵列技术,对比绝经后骨质疏松症组和骨量正常的绝经后女性的外周血单核细胞miRNA表达谱的变化。选取表达显著下调的miR-503作为进一步研究的对象。通过实时定量PCR(quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)方法验证MiR-503在所有51名对象PBMCs中的表达情况。结果：(1)26名符合绝经后骨质疏松症诊断标准,25名相应年龄段的绝经后女性的骨密度正常。两组人群在年龄、体重、血液雌二醇水平方等面均匹配,并且两组人群在饮食钙摄入量、绝经年限、体育锻炼、血清完整的甲状腺激素(parathyroid hormone, PTH)水平、血清25-羟维生素D、血清肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor a,TNF-α)等水平均无明显差异。骨源性碱性磷酸酶(bone-formationmarker bone-specific alkaline phosphatase, BAP)在绝经后骨质疏松症患者中减低(P<0.05)。(2)通过密度梯度离心法成功从外周血中分离出单核细胞,采用磁珠分选(magnetic activated cell sorting, MACS)系统分选出高纯度的CD14+PBMCs;(3)采用microRNA microarray技术检测绝经后骨质疏松症组和骨量正常组CD14+PBMCs miRNA表达谱变化,识别5个差异表达的miRNAs——在骨质疏松症患者中hsa-miR-503, hsa-miR-218, hsa-miR-618表达下调,而hsa-miR-133a, hsa-miR-107表达上调,以hsa-miR-503表达下调最为明显。(4)通过PCR验证miR-503在所有的51名对象中均有表达,且表达模式与miRNA微阵列吻合,即在绝经后骨质疏松症组表达水平明显低于骨量正常的绝经后女性组。结论：应用microRNA芯片发现绝经后骨质疏松症患者CD14+PBMCs中micorRNA表达谱的差异,在骨质疏松症患者中Hsa-miR-503, hsa-miR-218, hsa-miR-618表达下调,而hsa-miR-133a, hsa-miR-107表达上调,其中hsa-miR-503表达下调最为明显。qRT-PCR进一步发现在所有绝经后骨质疏松症人群中均有miR-503表达下调。第二部分miR-503调控破骨细胞分化及其对去卵巢小鼠骨代谢的影响目的：从细胞水平研究hsa-miR-503在CD14+PBMCs向破骨细胞分化过程中的作用,从动物水平研究hsa-miR-503对骨代谢的影响。方法：细胞水平,分别以miRNA前体(pre-miR-503)和miRNA阻滞剂(antagomiR-503)转染绝经后正常女性的CD14+PBMCs,用Northern Blot检测转染后细胞中成熟miR-503的表达水平,然后用人核因子KB受体活化素配体(human receptor activator of nuclear factor-κB ligand, hRANKL)和重组人巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human-macrophage colony stimulating factor, rh-MCSF)诱导,使CD14+PBMCs向破骨细胞分化,实时定量PCR检测破骨细胞分化的关键转录因子NFATc1(Nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic)及具有破骨细胞特异性的抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP) mRNA水平,TRAP染色观察破骨细胞分化情况。绝经后骨质疏松症患者的CD14+PBMCs中,转染pre-miR-503恢复miR-503表达后,诱导CD14+PBMCs向破骨细胞分化,实时定量PCR检测破骨细胞分化指标TRAP、NFATc1mRNA水平,行TRAP染色检测TRAP+的多核巨细胞数目。动物水平,小鼠分为(Ovariectomy, OVX)手术组和假手术组(SHAM groups),去卵巢小鼠模拟绝经后状态,分别用miR-503激动剂ago-miR503或miR-503的阻滞剂antagomiR-503实现活体内骨组织miR-503过表达或表达受抑,用双能Χ线骨密度仪检测股骨颈骨矿密度(bone mineral density, BMD), MicroCT检测骨微结构,并通过实时定量PCR检测TRAP. NFATc1mRNA水平。结果：(1)用pSilencer4.1-CMV puro构建pre-miR-503(hsa-miR-503的表达载体),转染后在PBMCs中高表达hsa-miR-503; antagomiR-503转染PBMCs后抑制hsa-miR-503表达。(2)在绝经后骨量正常女性的PBMCs中,hsa-miR-503过表达抑制TRAP+的多核巨细胞形成,TRAP、NFATc1mRNA水平下降,相反,在转染antagomiR-503的细胞中,上述与破骨细胞分化相关的指标均显著增加。在绝经后骨质疏松症患者PBMCs中,恢复hsa-miR-503能抑制TRAP阳性多核巨细胞形成形成,降低TRAP、NFATc1mRNA水平。(3)动物模型中ago-mir503可导致小鼠体内miR-503过表达,antagomiR-503导致小鼠体内miR-503表达受抑。(4)动物水平,在假手术组中,过表达hsa-miR-503可导致骨密度增加,骨微结构改善,抑制hsa-miR-503可导致骨密度减少,骨微结构破坏。在去卵巢小鼠中恢复hsa-miR-503表达可抑制骨吸收,阻止骨丢失。结论：(1)骨量正常绝经后女性CD14+PBMCs中hsa-miR-503过表达可使CD14+PBMCs向破骨细胞分化过程受抑制,而抑制hsa-miR-503表达后可促进CD14+PBMCs向破骨细胞分化。进一步研究发现,在绝经后骨质疏松症患者CD14+PBMCs恢复miR-503表达可阻止破骨细胞分化。(2)动物水平抑制hsa-miR-503可导致骨密度减少,骨微结构破坏。在去卵巢小鼠中恢复hsa-miR-503表达可导致骨密度增加,骨微结构改善。第三部分hsa-miR-503调控破骨细胞分化的机制研究目的：预测并验证hsa-miR-503的直接有效靶基因,探索hsa-miR-503抑制CD14+PBMCs向破骨细胞分化的具体机制。方法：通过靶基因预测软件(RNA22)预测得到hsa-miR-503作用的可能的靶基因。用M-CSF与RANKL共同诱导绝经后骨质疏松症患者和绝经后骨量正常女性的CD14+PBMCs向破骨细胞分化,用Northern blot检测RNAK mRNA、miR-503水平,Western blot检测RNAK蛋白水平,比较MiR-503与RANK在破骨细胞分化中的表达模式。然后将包含hsa-miR-503结合位点的靶基因——核转录因子-κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB, RANK)的编码序列(Coding sequence, CDS)片段克隆到pGL3载体的编码区(CDS),构建报告载体WT-pGL3-RANK(野生型)。用QuickChange site-directed mutagenesis试剂盒构建结合位点含有突变的报告载体MUT-pGL3-RANK(突变型)。将这上述载体分别与pre-miR-503或miR-C(对照)共同转染细胞CD14+PBMCs,检测荧光素酶活性,以证实RANK是hsa-miR-503作用的直接靶基因。最后,以pre-miR-503和antagomir-503分别转染PBMCs, RT-PCR和Western blot分别检测RNAK mRNA和蛋白表达水平的变化,明确hsa-miR-503对靶基因的调控作用。结果：(1)靶基因预测软件RNA22预测hsa-miR-503的靶基因为RANK。(2)绝经后骨量正常女性的CD14+PBMCs向破骨细胞分化时1miR-503轻度上升,RANK mRNA水平明显上升,RANK蛋白水平增加不明显；来源于绝经后骨质疏松症患者的CD14+PBMCs向破骨细胞分化时,miR-503基线水平较正常对照低,而RANK mRNA以及蛋白水平均增加。(3)pre-miR-503和WT-pGL3-RANK(野生型)共转染后荧光素酶活性较对照组显著降低,而pre-miR-503和MUT-pGL3-RANK(突变型)共转染的荧光素酶活性较对照组变化不明显。(4)pre-miR-503转染CD14+PBMCs可以降低RANK蛋白水平,而对RANK mRNA水平无影响。用antagomiR-503单独转染增加RANK蛋白水平,而对RANK mRNA水平无影响。因此,hsa-miR-503通过抑制靶基因RANK,使蛋白表达降低,从而抑制破骨细胞分化。结论：(1)通过RNA22靶基因预测工具并经荧光素酶报告基因系统明确RANK为hsa-miR-503作用的靶基因。(2)绝经后骨质疏松症患者和骨量正常人群的CD14+PBMCs向破骨细胞分化过程中,MiR-503与RANK表达模式符合microRNA与靶基因作用规律。(3)hsa-miR-503在转录后水平抑制RANK表达,抑制破骨细胞分化。