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根据2014年公布的《全国土壤污染状况公报》,我国因镉(Cadmium,Cd)的大量使用使其成为土壤中超标率最高的无机污染物。近年来随着我国蛋鸡规模化养殖的不断扩大,研究发现环境Cd暴露使得蛋鸡养殖过程中暴露出许多问题,其中蛋鸡肝脏脂肪沉积、肝脏发生脂肪变性、非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)等肝脏脂代谢紊乱相关疾病引起人们的高度重视。线粒体作为机体糖、脂肪、氨基酸代谢的核心细胞器,在维持肝脏脂代谢过程中发挥着重要作用。线粒体损伤直接导致肝脏脂代谢紊乱,细胞和组织内发生脂肪沉积。PINK1/Parkin介导的线粒体自噬参与损伤线粒体的清除,是控制细胞线粒体数量及质量的主要机制。然而,线粒体自噬在Cd致家禽脂肪沉积中的作用机制尚不明确。本试验以原代鸡胚肝细胞和鸡胚肝组织为研究对象,通过蛋白免疫印迹(Western blot)、实时荧光定量(QRT-PCR)、免疫荧光法(Immunofluorescence)等技术手段,揭示PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在Cd致原代鸡胚肝细胞和肝组织脂肪变性中的作用。1.Cd对原代鸡胚肝细胞和肝组织脂肪变性的影响为了探究Cd对原代鸡胚肝细胞和鸡胚肝组织脂代谢的影响,以原代鸡胚肝细胞和肝组织作为研究对象,使用不同浓度的Cd(0、2.5、5、10 μM)处理原代鸡胚肝细胞6h,7日龄鸡胚卵黄囊注射不同浓度的Cd(0、10、100、200、500、1000 nM)培养7 d。试剂盒检测原代鸡胚肝细胞和肝组织TG含量,QRT-PCR检测脂代谢相关基因转录水平,尼罗红荧光染色观察原代鸡胚肝细胞内脂肪滴蓄积情况,HE染色观察鸡胚肝组织内脂肪空泡化情况。结果显示,与对照组相比,镉处理组原代鸡胚肝细胞和肝组织内TG含量均显著升高(P<0.05或P<0.01),脂肪酸合成相关基因(FASN、SREBP、SCD、ACACA)转录水平均呈现不同程度升高(P<0.05或P<0.01),脂肪酸分解相关基因(ATGL、ACOX1、LPL、CPT1)转录水平均呈现不同程度下降(P<0.05或P<0.01),原代鸡胚肝细胞和肝组织内脂滴蓄积加重,细胞内脂溶性空泡极显著增多。表明Cd通过干扰正常脂肪酸代谢引起原代鸡胚肝细胞和肝组织发生脂肪变性。2.PINK1/Parkin参与Cd致原代鸡胚肝细胞和肝组织线粒体自噬为了研究Cd对原代鸡胚肝细胞及肝组织脂代谢的影响,以原代鸡胚肝细胞和鸡胚肝脏组织为研究对象,使用不同浓度的Cd(0、2.5、5、10μM)处理鸡胚肝细胞6h,7日龄鸡胚卵黄囊注射不同浓度的Cd(0、10、100、200、500、1000 nM)培养7 d。透射电镜观察原代鸡胚肝细胞和肝组织线粒体超微结构及线粒体自噬体的形成,免疫荧光法检测原代鸡胚肝细胞线粒体和自噬小体共定位程度,Western Blot检测原代鸡胚肝细胞和肝组织LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白表达水平。结果表明,与对照组相比,Cd处理组原代鸡胚肝细胞和肝组织线粒体肿胀变圆,线粒体膜结构不完整,形成线粒体自噬体;线粒体与自噬体有明显的共定位;原代鸡胚肝细胞和肝组织中LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白表达水平均显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)。表明Cd导致原代鸡胚肝细胞和肝组织细胞线粒体损伤,发生线粒体自噬,PINK1/Parkin途径参与了损伤过程的调控。3.PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在Cd致原代鸡胚肝细胞和肝组织脂肪变性中的作用为了探究线粒体自噬在Cd致原代鸡胚肝细胞和肝组织脂肪变性过程中的分子机制,以原代鸡胚肝细胞和胚肝脏组织作为研究对象。1 μM环保霉素A(Cyclosporine A,CsA)与10 μM Cd单独或共处理原代鸡胚肝细胞6 h,1 μM CsA与1 μM Cd单独或共处理鸡胚肝组织7 d。透射电镜观察线粒体超微结构的变化及线粒体自噬体的形成,试剂盒检测原代鸡胚肝细胞和肝组织TG含量,尼罗红荧光染色观察细胞内脂肪滴蓄积情况,HE染色观察组织内脂肪空泡化情况,QRT-PCR检测脂代谢相关基因转录水平,Western Blot检测LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白表达水平。结果表明,与Cd组相比,1μM CsA可以抑制Cd诱导的原代鸡胚肝细胞和肝组织线粒体自噬体的形成,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白表达量显著下降(P<0.05或P<0.01);原代鸡胚肝细胞内TG含量极显著升高(P<0.01),脂质合成相关基因转录水平均极显著升高(P<0.01),脂质分解相关基因转录水平显著降低(P<0.05或P<0.01);1μM CsA有效抑制了鸡胚肝组织内Cd致鸡胚肝组织脂肪滴的蓄积,TG生成极显著减少(P<0.01),脂代谢相关基因转录水平恢复正常水平。表明抑制线粒体膜电位去极化,可以有效抑制Cd致原代鸡胚肝细胞和肝组织PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,加重了Cd致原代鸡胚肝细胞脂肪变性,而有效缓解Cd引起的鸡胚肝组织脂肪变性。综上所述,Cd干扰正常脂肪酸代谢导致原代鸡胚肝细胞和肝组织脂肪变性,主要表现线粒体肿胀、形成线粒体自噬体,PINK1/Parkin途径参与调控Cd致原代鸡胚肝细胞和肝组织线粒体自噬的发生。