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奶牛乳房炎是奶牛场危害大、花费高、防治难的疾病,长期以来,该病一直是困扰世界奶牛业健康发展的重大疾病之一。乳腺上皮细胞既是抵御病原微生物入侵的天然屏障,同时也启动了机体对病原微生物最早的免疫识别和免疫应答,并发挥了协调后续免疫分子、免疫细胞应答的重要作用。外泌体是细胞对外分泌的小囊泡,为40-120 nm大小的膜包裹结构,可特异性地包裹一些蛋白质、脂质或miRNA等物质,具有生物活性,能够被受体细胞吸收,实现细胞间的物质运输和信息传递。LPS刺激上皮细胞后可能影响其外泌体中miRNA模式,进而影响乳腺炎症的发展过程和牛奶品质。因此,本实验拟对LPS刺激乳腺上皮细胞后产生的外泌体进行分离鉴定,筛选乳腺感染时上皮细胞产生的外泌体中发挥调控功能的关键miRNA。采用超速离心的方法来提取正常奶牛乳腺上皮细胞来源和LPS刺激6 h之后的奶牛乳腺上皮细胞来源的外泌体,并对提取到的外泌体通过蛋白浓度测定、透射电镜及Western blot技术进行鉴定与分析,进行高通量测序,筛选可能调控影响乳腺炎症的miRNA。结果显示电镜下外泌体颗粒直径在40-120 nm之间,均一性良好,符合外泌体预期特征;Western blot结果显示,外泌体表面标志物CD63、HSP70和HSP90结果均为阳性,综上显示成功提取得到外泌体。将测序得到的序列进行新的miRNA预测分析,共有400个新miRNA被预测出来;差异表达分析结果显示有44个表达差异的miRNA,其中上调的有21个,下调的有23个;而后对差异表达的miRNA对应着的43784个靶基因进行GO和KEGG生物信息学分析,结果显示筛选的差异miRNA参与蛋白结合、Th17细胞分化和调节机制、代谢过程、细胞通讯调节等生物过程,通过高通量测序结果中筛选出可能调控影响乳腺炎症的miRNA,与炎症相关bta-miR-146a、bta-miR-148a、bta-miR-224均表达差异,推测这些miRNA调控乳腺炎症的发生发展。本研究分离正常和LPS刺激后的奶牛乳腺上皮细胞来源的外泌体,筛选了外泌体中的差异miRNA,为进一步研究乳腺感染时乳腺上皮细胞产生的外泌体能否调控PMN功能奠定基础。