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草甘膦作为一种广谱、低毒、有效的有机磷类除草剂对一年、多年生植物具有较强的除杀能力,成为除草剂中的重要品种,被人们广泛使用。但喷施除草剂草甘膦在杀死杂草的同时也将农作物非选择性的除杀,给农民造成了不必要的损失。利用基因工程方法培育抗除草剂转基因作物成为最方便最根本地防治杂草的方法。
本实验利用农杆菌介导的方法,将除草剂草甘膦抗性基因aroA导入到玉米自交系综31,经培养基除草剂梯度筛选,获得33株再生苗。提取33棵的TO代转基因植株的叶片DNA,分别用目的基因和筛选基因的引物进行PCR扩增,获得10株阳性植株。现已收获T1代转基因玉米籽粒。
实验中构建两个烟草转化载体:含有信号肽的转基因载体和非含信号肽的转基因载体,利用农杆菌介导的方法,将抗除草剂草甘膦基因aroA导入到烟草中,经除草剂筛选培养得到再生苗。通过PCR鉴定,含有信号肽以及非信号肽转基因烟草共获得23株、16株阳性株。从以上含有以及不含有信号肽的转基因烟草中各选取6株(SP10、SP18、SP19、SP24、SP25、SP44)、4株(9-2、22-3、37-3、55-2)健壮阳性株提取基因组RNA进行RT-PCR检测,由RT-PCR结果可以看出,所选取得转基因烟草均扩出目的基因,说明目的基因已转入到烟草中。而且各株系的目的基因表达量不同(9-2、55-2、SP10、SP19、SP24、SP44的表达量较高,而22-3、37-3、SP18、SP25表达量比较低,野生型没有表达)。
实验中还对转基因烟草以及野生型烟草的草甘膦抗性进行了比较。分别在3-4叶期喷施1.65g/L草甘膦以及在6-7叶期喷施2.15g/L草甘膦,三周后观察。结果表明,转基因烟草表现出较野生型烟草更高的抗性。除此之外,含有信号肽的转基因烟草的草甘膦抗性比非含信号肽载体的转基因烟草高。而且非含信号肽载体的转基因烟草也表现出比野生型较高的抗性,这是因为非含信号肽载体的转基因烟草虽然不含有叶绿体定位信号肽,但可产生胞质型EPSP合酶,可能有一定的EPSP合酶可通过一定的通道进入到叶绿体中,因此表现出一定的草甘膦抗性。此外结合RT-PCR结果可以看出,转基因植株抗性与目的基因表达量有关,即表达量高则抗性相对较高,反之亦然。