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目的通过薄膜水化法,将脂质体DPPC和DSPE制备成携带有生物素的纳米级微泡。利用生物素——亲和素系统,对纳米级微泡和IDH1-siRNA进行连接,制备纳米微泡-siRNA复合体。超声辐照对纳米微泡-siRNA进行靶向破碎,分别从体内及体外实验,验证siRNA的转染及干扰效率的提高,从而达到抑制肿瘤细胞生长的效果,为肿瘤的基因及药物治疗载体选择提供新思路。方法1.将脂质体DPPC和DSPE-PEG（2000）-biotin溶于2ml氯仿。旋转蒸发后,加入1ml水合液,并于恒温摇床内震荡。500μl脂质体水合液加入密封小管内。将小管内空气置换为惰性气体C3F8。银汞调和器内震荡小管45s后,取出管内悬液并用PBS稀释至8ml。同时制备微泡作为对照。利用动态光散射粒度/电位分析仪对制备的纳米及微米气泡进行粒径分析。扫描电镜观测NBs外观。CCK-8检测NBs细胞毒性。2.NBs-siRNA的制备及其检测:利用无RNA酶的PBS将100ul NBs悬液稀释至850ul。加入100ul链霉亲和素水溶液。小管旋转器上震荡小管30min。完成后,添加50ul的20u M siRNA溶液。继续震荡30min后,置于4℃冰箱静置90min。待溶液分层后,吸取下层澄清溶液,并加入等量的无RNA酶的PBS溶液。重复此步骤两至三次。NBs-siRNA复合体制备完成。以的同样方法制备NBs-SCR和NBsFAM-SCR。NBs-siRNA制备完成后,立即检测其粒径。将样品置于25℃,分别于15min,30min,45min和60min后检测。同时利用血球计数板对NBs-siRNA复合体进行计数,并进行统计学分析。荧光显微镜观测NBs-FAM-SCR溶液。同时空白NBs作为对照。3.细胞转染:以5 x104个细胞/每孔的浓度将胶质瘤细胞U87种植于12孔板。每孔内添加样品后,利用超声探头进行辐照,超声参数为:1MHz,0.88 W/cm2声强,45s辐照时间。4.激光共聚焦扫描显微镜观测NBs-FAM-SCR转染效率:实验分为三组:NBs携带FAM荧光标记的乱序siRNA结合超声辐照组（NBs-FAM-SCR-UI）,单纯FAM荧光标记的乱序siRNA结合超声辐照组（FAM-SCR-UI）,空白FAM荧光标记的乱序siRNA（control）。利用DAPI试剂对细胞核进行染色。激光共聚焦扫描显微镜对细胞进行观测。5.生物学检测目的基因干扰效果:1)real-time PCR检测目的基因m RNA水平表达情况。实验分为三组:NBs携带siRNA结合超声辐照（NBs-siRNA-UI）,siRNA结合超声辐照（siRNA-UI）,NBs携带乱序siRNA结合超声辐照（control）。转染后进行real-time PCR反应。2)蛋白质印迹法（Western blot analysis）检测目的基因蛋白水平表达。实验分组同前。6.细胞凋亡及细胞活性检测:实验分组同前。1)Annexin-V检测细胞凋亡情况。2)CCK-8检测细胞活性。根据结果进行统计学分析。7.无胸腺裸鼠胶质瘤模型用于体内研究。5×106个U87胶质瘤细胞悬液注射于裸鼠背侧右大腿根部区域。8.NBs-siRNA的活体内分布:1)尾静脉注射NBs-siRNA悬液,同时利用超声探头对肿瘤内增强造影进行观测。肿瘤内增强造影出现15s后,对肿瘤内进行超声靶向微泡破碎。记录超声靶向微泡破碎前后的图像,与未进行超声靶向微泡破碎的对照组进行比较。2)200ul Dil-NBs-siRNA和MBs-siRNA溶液分别尾静脉注射入携带胶质瘤异位模型的裸鼠体内。肿瘤组织进行石蜡切片及免疫荧光染色。激光共聚焦显微镜进行观测。3)荷瘤裸鼠尾静脉注射Dil标记的NBs-siRNA,分别于10min,30min,60min,6h,12h和24h后处死裸鼠,取裸鼠肿瘤、肝及脾脏。小动物活体荧光成像系统对荧光分布进行观测。9.体内治疗效果观测:实验分四组进行:纳米微泡携带siRNA结合超声靶向微泡破碎（NBs-siRNA-UI）;微泡携带siRNA结合超声靶向微泡破碎（MBs-siRNA-UI）;纳米微泡携带siRNA不结合超声靶向微泡破碎（NBs-siRNA）;纳米微泡携带SCR结合超声靶向微泡破碎（NBs-SCR-UI）。200ul悬液经尾静脉注射后,对肿瘤区域进行超声辐照。1)记录各组肿瘤生长情况及裸鼠生存时间,进行分析。2)取肿瘤组织制备病理切片。对切片H&E染色及TUNEL染色,观测肿瘤组织生长及凋亡情况。结果1.粒径检测结果显示:纳米微泡的平均粒径为625.4±63.8nm（n=3）,而微泡的平均粒径为2355.8±512.8nm（n=3）。SEM观测下,纳泡为均为单一类圆形空洞,其观测到的粒径约为400-800nm,与DLS的检测结果基本相符。CCK-8毒性试验结果显示当脂质体（NBs和MBs的制备材料）浓度增至10ug/ml时,出现明显细胞毒性。2.室温下NBs-siRNA粒径随时间变化为688.23±61.4nm（1min,n=3）,740.33±54.88nm（15min,n=3）,756.37±51.20nm（30min,n=3）,789.13±62.22nm（45min,n=3）,870.17±93.09nm（60min,n=3）。经统计学分析,与1min组相比,各时间点粒径没有统计学差异。NBs-siRNA浓度稳定性结果为88.34×105±6.59×105/ml（1min,n=5）,77.02×105±6.62×105/ml（15min,n=5）,70.76×105±4.29×105/ml（30min,n=5）,62.00×105±7.53×105/ml（45min,n=5）,50.72×105±6.91×105/ml（60min,n=5）。统计学分析显示,与1min组相比,各时间点浓度有统计学差异。利用荧光显微镜对NBs-FAM-SCR和空白NBs进行观测,结果显示,NBs-FAM-SCR组可观测到明显的绿色荧光而空白NBs组未观测到。3.利用激光共聚焦显微镜检测了超声辐照纳米微泡对细胞转染FAW-SCR效果的影响。结果显示可在NBs-FAM-SCR-UI组和FAM-SCR-UI组的细胞核（蓝色荧光）周边观测到FAW的绿色荧光。阴性对照组细胞仅可观测到细胞核的蓝色荧光,而没有绿色荧光。与NBs-FAM-SCR组相比,NBs-FAM-SCR-UI组的细胞内,可观测到更多绿色荧光。4.Real-time PCR和western blot实验结果显示无论m RNA水平还是蛋白水平,NBs-siRNA-UI组和siRNA-UI组目的基因的表达与对照组相比都明显降低,其中NBs-siRNA-UI组降低更为明显。流式细胞仪检测细胞凋亡及CCK-8细胞活性检测都显示,实验组NBs-siRNA-UI组细胞凋亡更为明显,细胞活性更低。5.NBs-siRNA悬液注射后,超声显示裸鼠肿瘤内均出现了对比增强,但经过超声靶向微泡破碎辐照后,辐照组增强显影明显低于非辐照组。统计学分析超声辐照后两组图像灰阶值,有明显统计学差异。6.激光共聚焦显微镜观测肿瘤组织切片,结果显示,Dil labeled NBs-siRNA组肿瘤组织血管外细胞间隙可观测到Dil的红色荧光,而注射Dil labeled MBs-siRNA的对照组肿瘤组织中未观测到红色荧光。小动物活体成像系统观测肿瘤、肝脏及脾脏组织中Dil labeled NBs-siRNA的分布,结果显示样品注射后,肿瘤组织及肝脏组织的初始荧光强度较高,而脾脏内荧光强度持续维持在一个相对较低的水平。7.通过对肿瘤生长曲线及荷瘤裸鼠生存曲线进行分析评估NBs-siRNA结合超声靶向微泡破碎的治疗效果。结果显示,与其它三组相比,NBs-siRNA-UI组的肿瘤生长更为缓慢,肿瘤体积更小。同时NBs-siRNA-UI组荷瘤裸鼠的生存期更长。H&E染色及TUNEL凋亡染色结果显示,NBs-siRNA-UI组比其他三组肿瘤细胞更少,细胞多态性更低,凋亡细胞比例更高。结论通过薄膜水化法制备了纳米级微泡,并利用生物素-亲和素系统将纳米微泡和siRNA相连接,通过超声靶向微泡破碎,提高了siRNA的体外转染效率及对目的基因的沉默效果,达到了抑制胶质瘤细胞生长的目的。与MBs-siRNA复合体相比,由于其较小的粒径,NBs-siRNA复合体可以透过肿瘤血管壁进入肿瘤组织间隙,联合UTMD提高了肿瘤细胞对siRNA的摄取及siRNA的干扰效率,进而抑制、延缓了胶质瘤的生长,并延长荷瘤裸鼠的生存期,初步实现了抑制活体内胶质瘤生长的作用。NBs可以作为siRNA的载体,为胶质瘤的无创治疗提供新思路。