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背景和目的苦参素是传统中药苦参提取的一种生物碱活性成分,近来研究表明它具有广泛的抗肿瘤作用,然而其在结肠癌具体的作用机制不清。本研究的目的是探讨苦参素在结肠癌细胞的作用,阐明其对结肠癌上皮间质转化的影响及其可能涉及的机制,为中药单体治疗结肠癌提供实验依据。方法1.体外培养结肠癌细胞,观察细胞的生长状态,取处于对数生长期的细胞用于实验。试验分为:(1)实验组:用不同浓度的苦参素(mg/ml)(0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2)处理结肠癌细胞。(2)对照组:未经药物处理,仅加入细胞悬液。(3)空白对照组:未加入细胞,仅加入细胞培养液。运用MTT法使用不同浓度的苦参素(mg/ml)(0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2)作用于SW480,RKO,HCT116等结肠癌细胞24h后检测细胞的增殖活性;不同浓度的苦参素(mg/ml)(0,0.25,0.5,0.75)干预结肠癌细胞RKO 24小时后,应用细胞划痕实验和Transwell小室模型分别进行细胞迁移、细胞侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力;苦参素干预之前和干预之后的结肠癌细胞形态学上的改变由应用倒置相差显微镜观察。将结肠癌细胞RKO分为四组,即苦参碱素干预的终浓度分别为0、0.25、0.5、0.75(mg/ml),应用免疫印迹法(Western Blotting)检测各组细胞E-cadherin、N-cadherin、Snail、P65蛋白水平的表达情况。2.利用基因干扰技术设计并合成干扰效率较高的P65sh RNA。实验分为四组,分别是对照组、苦参素组(终浓度0.25mg/ml)、P65sh RNA组、苦参素(终浓度0.25mg/ml)+P65sh RNA组,应用免疫印迹法(Western Blotting)检测各组细胞E-cadherin、N-cadherin、Snail的蛋白水平表达情况,应用倒置相差显微镜观察各组细胞的形态改变,应用细胞划痕实验和Transwell小室模型分别进行细胞迁移、细胞侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果1.MTT实验表明苦参素能够抑制结肠癌细胞的增殖,当苦参素的干预浓度在0~2mg/ml范围时,随着苦参素干预浓度的增大,其对结肠癌细胞的增殖抑制越明显。不同浓度的苦参素(mg/ml)(0、0.25、0.5、0.75)作用于结肠癌RKO细胞24小时后,各组的迁移距离分别为263.00±25.51,170.25±46.38、103.87±33.90、75.46±20.19。Transwell小室侵袭实验中,0mg/ml组、0.25mg/ml组、0.5mg/ml组、0.75mg/ml组中穿过上室的细胞数分别是:166±8.89、130.65±10.23、93.60±9.21、62.28±7.07。倒置相差显微镜下可见苦参素处理前细胞呈间质样的细长梭形,细胞连接松散;苦参素处理后细胞呈上皮样的形态,细胞间连接紧密,几乎看不到伪足。Western Blotting法结果显示,0mg/ml组、0.25mg/ml组、0.5mg/ml组、0.75mg/ml组中所对应的E-cadherin的蛋白表达结果分别为:0.30±0.08、0.48±0.19、0.72±0.13、1.06±0.44;N-cadherin的蛋白表达结果分别为:0.50±0.10、0.33±0.09、0.25±0.08、0.18±0.05;Snail的蛋白表达结果分别为:0.88±0.04、0.43±0.11、0.33±0.11、0.20±0.07。P65的蛋白水平结果分别为:0.75±0.03、0.40±0.08、0.34±0.08、0.20±0.06。综上,随着苦参素干预浓度的增大,N-cadherin、Snail、P65的蛋白表达减少,而E-cadherin的蛋白表达增加。2.成功设计、合成出一条干扰效率较高的P65sh RNA。对照组、苦参素组、P65sh RNA组、苦参素+P65sh RNA组中所对应的E-cadherin蛋白表达结果分别为:0.16±0.01、0.23±0.02、0.33±0.03、0.5±0.06;N-cadherin的蛋白表达结果分别为:0.60±0.04、0.46±0.07、0.32±0.06、0.20±0.05;Snail的蛋白表达结果分别为:0.93±0.04、0.71±0.12、0.62±0.10、0.35±0.07。综上,N-cadherin、Snail的蛋白表达水平,P65sh RNA组的低于苦参碱组,苦参素+P65sh RNA均低于苦参素组及P65sh RNA组,E-cadherin蛋白表达水平恰好相反。倒置相差显微镜下可见对照组细胞呈间质样的细长梭形,大多数细胞出现细长的丝状伪足,细胞连接松散,苦参素组或P65sh RNA组较对照组细胞连接紧密。相对于苦参素组或P65sh RNA,苦参素+P65sh RNA组细胞进一步呈明显的上皮样形态,细胞间连接紧密,几乎看不到伪足,细胞呈紧密连接的鹅卵石样改变。空白对照组,苦参素组、P65sh RNA、苦参素+P65sh RNA组相对应的迁移距离分别为297.31±65.91、180.00±50.24、116.84±36.89、59.09±15.36。Transwell小室侵袭实验中,对照组,苦参素组、P65sh RNA组、苦参素+P65sh RNA组相对应的穿过上室的细胞数分别是143.67±10.97、119.33±20.23、97.67±18.77、50.33±8.50。结论1.苦参素在体外具有抗结肠癌细胞的作用,具体表现在其能够抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。2.苦参素能影响结肠癌细胞上皮间质转化相关蛋白,其能抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭能力,与抑制结肠癌细胞上皮间质转化有关。3.苦参素能影响NF-?B信号通路相关蛋白,其抑制结肠癌细胞上皮间质转化的能力,可能是通过抑制NF-?B通路来实现。