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【目的】现有实验室诊断方法的局限性是结核（Tuberculosis,TB）具有高发病率和高死亡率的重要原因。建立结核生物标志物直接检测方法,对结核病的诊治和防控具有重要意义。培养滤液蛋白10（Culture filtrate protein,CFP-10）是公认的结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis,Mtb）感染代表性生物标志物。但是,目前缺少具有高灵敏度和高特异性的CFP-10抗原直接检测方法。本研究的目的是评估质谱技术定量检测血清样本中CFP-10抗原的可能性,建立基于质谱技术的结核生物标志物CFP-10检测方法,并对幼儿结核、儿童结核以及免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）感染结核人群的血液样本进行检测,评估血清CFP-10检测对结核病的诊断潜能。【方法】1.纳入南非HIV暴露的3-4月龄幼儿,在4年随访过程中评估其是否发展为结核病。根据幼儿临床表现、实验室诊断、组织病理学和放射学证据进行综合诊断,将幼儿分为确诊结核（Confirmed TB）、临床诊断结核（即未确诊结核,Unconfirmed TB）和不太可能结核（Unlikely TB）。每次随访采集幼儿血液标本以血清形式冻存,最终对519例HIV暴露幼儿（HIV感染284例,HIV未感染235例）的660份血清样本应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time to flight-Mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）和纳米盘进行CFP-10定量检测。2.应用高效液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS）和多重反应监测（Multiple reaction monitoring,MRM）技术开展研究。通过优化前处理步骤、色谱和质谱条件,建立基于LC-MS/MS-MRM的血清CFP-10检测新方法。对新建方法的线性范围、检测限、定量限、日间/日内精密度、准确度、加标回收率、基质效应和残留效应进行方法学评估。3.纳入13岁以下可疑儿童结核,随访6个月。根据儿童临床表现、实验室、病理学和放射学证据进行综合诊断,将儿童分为确诊结核、临床诊断结核和不太可能结核。分别采集患儿入组时、抗结核治疗2个月后以及抗结核治疗6个月后血清样本。运用已建立的血清CFP-10质谱检测新方法,对收集的血清样本进行CFP-10定量检测。评估基于LC-MS/MS-MRM的血清CFP-10检测对儿童结核的诊断能力,并与其他结核诊断方法（结核培养、Xpert MTB/RIF[简称Xpert]、结核菌素皮肤试验[Tuberculosis skin tests,TST]和胸部X片[Chest X-ray,CXR]）进行比较。4.选择衣壳蛋白p24作为HIV-1感染生物标志物,筛查具有HIV-1高度特异性的p24肽段。通过联合Mtb毒力因子CFP-10特异性肽段和p24肽段,建立基于LCMS/MS-MRM的血清多重检测方法,用以分析来自同一血清样本的CFP-10和p24肽段,同时诊断TB和HIV感染。对新建方法的线性范围、检测限、定量限、日间/日内精密度、准确度、加标回收率和基质效应进行方法学评估。纳入56例成人患者（31例HIV-1阳性,25例HIV-1阴性）和26例婴儿（16例HIV-1阳性,25例HIV-1阴性）评估p24质谱检测对HIV-1感染的诊断能力,并与酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time Quantitative polymerase chain reaction,q PCR）进行对比。纳入20例患者（7例HIV-1/TB共感染,4例单独TB感染,1例单独HIV感染,8例非感染对照患者）评估血清多重检测方法对HIV-TB共感染的诊断潜能。【结果】1.HIV感染幼儿中,基于MALDI-TOF的血清CFP-10检测对确诊结核敏感性为100%（5/5,95%置信区间[CI],47.8-100%）,对临床诊断结核敏感性为83.7%（36/43,95%CI,69.3-93.2%）,特异性为93.1%（203/218,88.9-96.1%）。HIV未感染幼儿中,基于MALDI-TOF的CFP-10检测可检出全部确诊结核（1例）,以及75.0%的临床诊断结核（15/20,95%CI,50.9-91.3%）,特异性为96.2%（177/184,95%CI,92.3-98.5%）。此外,CFP-10阳性信号最早可在幼儿结核诊断前60周中检出。在结核诊断前24周,CFP-10检测的整体敏感性可达76.5%（13/17,95%CI,50.1-93.2%）。抗结核治疗开始后,CFP-10检测阳性率和信号水平均下降。2.本研究成功建立了基于LC-MS/MS-MRM的血清CFP-10检测新方法。新检测方法的标准曲线在6.25-200f M范围内具有良好的线性关系。100u L血清样本中,CFP-10的检测限为2f M,定量限为7f M。血清CFP-10检测的日内/日间精密度均5岁患儿中敏感性（培养:83.3%;Xpert:55.6%;TST:66.7%;CXR:66.7%）高于年龄<5岁患儿敏感性（培养:34.8-38.1%;Xpert:30.4-38.1%;TST:47.6-66.7%;CXR:38.1-47.8%）,CFP-10检测敏感性在不同年龄儿童结核中相对稳定（71.4-88.9%）。抗结核治疗有效患儿中,CFP-10诊断阳性率随时间增加而降低。对于治疗无效患儿,CFP-10阳性率随时间增加,信号水平亦逐渐升高。4.本研究筛选出HIV-1特异性p24肽段（ETINEEAAEWER,1462.83 m/z）,联合CFP-10特异性肽段,成功建立了基于LC-MS/MS-MRM的血清多重检测方法。经方法学评估,我们发现血清多重检测方法检测CFP-10和p24的日内/日间精密度均<20%,准确度在94.1-109.4%之间,加样回收率在89.6-99.8%范围内,基质效应均符合生物样本的定量检测需求。临床初步验证结果显示,p24肽段诊断成人HIV-1感染的敏感性为90.3%（95%CI,74.3-98.0%）,特异性为100%（95%CI,86.3-100%）。诊断婴儿HIV-1感染敏感性为87.5%（95%CI,61.7-98.5%）,特异性为100%（95%CI,69.2-100%）。以q PCR为金标准,p24肽段诊断敏感性为88.9%,高于ELISA试验（55.6-66.7%）。血清多重检测方法诊断HIV-TB共感染患者的敏感性为85.7%（6/7,95%CI,42.1-99.6%）,总体特异性为100%（13/13,95%CI,75.3-100.0%）。HIV-TB共感染患者抗结核和抗逆转录病毒治疗（Antiretroviral therapy,ART）期间,动态监测CFP-10和p24的水平变化趋势能够反映HIV-TB共感染患者治疗效果、区分是否治疗失败、并可能为免疫重建炎性综合征（Immune Reconstitution Inflammatory Syndrome,IRIS）病例提供直观证据。【结论】1.基于MALDI-TOF和纳米盘的血清CFP-10检测,可快速诊断HIV感染和HIV未感染的幼儿结核,具有高敏感性和高特异性。血清CFP-10检测具有早期诊断结核和监测结核疗效的潜能。2.本研究首次建立了基于LC-MS/MS-MRM的血清CFP-10检测新方法,可对血液样本的结核生物标志物CFP-10进行定量检测。3.基于LC-MS/MS-MRM的血清CFP-10检测新方法能有效诊断儿童结核,对痰液方法容易漏诊的临床诊断结核具有高敏感性,且不受儿童年龄和HIV感染状态影响。血清CFP-10检测具有监测结核疗效潜能。4.本研究首次建立了基于LC-MS/MS-MRM的血清多重检测方法,可对血液样本的结核生物标志物CFP-10和HIV-1感染生物标志物p24进行同时定量检测。血清多重检测方法可用于诊断HIV-TB合并感染者,并具有同时监测患者ART和抗结核治疗的潜能。