研究背景众所周知,铁作为人体的必需微量元素,在氧转运,能量代谢和DNA合成等多个生理过程中起着重要的作用。虽然铁的摄入对机体是必不可少的,但是铁摄入过多会对机体产生危害,影响多种急慢性病症的发生发展。肝脏作为铁贮存的主要器官,在铁代谢中发挥着中枢调节作用,铁过负荷会对肝脏产生很大的危害。有研究发现,铁代谢紊乱可以引起肝脏炎症反应,是导致肝纤维化,肝细胞癌变或肝功能衰竭的重要原因之一。过去研究表明,铁过负荷fenton反应,产生氧自由基,激活巨噬细胞,产生大量炎症因子,引起炎症反应。近年来有研究发现,铁过负荷可以影响肝脏组织细胞microRNA表达变化。肝脏组织细胞miR-146α,122,155,132,34α在肝脏炎症发生发展过程中起着重要作用。我们前期的研究发现,肝铁过负荷引起的miR-122表达降低,与肝脏的炎症发生有关,但是过表达miR-122只能部分缓解肝铁过负荷导致的炎症,因此我们推测除了miR-122外,铁过负荷还会影响到其他与肝脏炎症反应有关的microRNA的表达。本课题首先利用芯片技术观察不同铁负荷2周小鼠肝脏基因和miRNAs表达变化特点,寻找目标基因及其可能存在的相互联系;在发现铁过负荷可引起miR-146α/TRAF6/NF-κB信号通路关键分子表达变化基础上,进一步分析铁过负荷肝细胞miR-146α表达下降的分子机制及其在肝脏炎症反应中的作用。研究目的本课题通过体内体外实验,明确铁过负荷肝脏组织细胞内与炎症相关的microRNA表达变化的特点;筛选目标microrna(miR-146α等),并分析其在肝脏炎症反应中的作用;在此基础上,进一步通过分子生物学技术,阐明铁过负荷引起目标microrna变化的机制,为寻找铁过负荷相关疾病防治潜在靶点提供实验依据。研究方法一、实验动物分组及处理(一)不同铁负荷小鼠肝脏基因和miRNAs芯片检测将雄性c57小鼠随机分为三组:缺铁组(irondeficiency,id),对照组(control,ctrl),铁过负荷组(ironoverload,io),三组小鼠自由饮水(去离子水)。进食纯化饲料(含铁量3ppm/kg,成分组成见附录),对照组小鼠按照20mg/kg腹腔注射右旋糖酐铁(浓度为2mg/ml),每周两次;铁过负荷组小鼠按照200mg/kg腹腔注射右旋糖酐铁(浓度为20mg/ml),每周两次。缺铁组小鼠按照相同体积腹腔注射0.9%生理盐水,每周两次。连续2周造模,麻醉处死小鼠,收集肝脏组织样本。(二)铁过负荷对肝脏mir-146α/traf6/nf-κb信号通路关键分子的影响1.不同铁制剂对小鼠肝脏炎症反应的影响将雄性c57小鼠随机分为以下四组:对照组(control,ctrl),右旋糖酐组(dextran,dext),右旋糖酐铁组(dextran-iron,deir)和蔗糖铁组(sucrose-iron,suir),均喂食全价饲料。按照同上方法连续4周造模,麻醉处死小鼠,收集肝脏组织样本。2.铁过负荷不同时间段对肝脏炎症影响将雄性c57小鼠随机分为两组:对照组(control,ctrl),铁过负荷组(ironoverload,io),所有小鼠均喂养纯化饲料,每组又分为三个亚组:饲养1周组,饲养2周组,和饲养4周组。按照同上方法造模,麻醉处死小鼠,收集肝脏组织样本。二、细胞培养及转染(一)细胞株的选择人肝癌细胞huh7,hepg2,lx-2培养在含10%胎牛血清,1%双抗(青链霉素混合液)的高糖dmem中,人肝细胞l02培养在含10%胎牛血清,1%双抗的高糖1640中。(二)分组按照实验的要求,选择相应的细胞株,进行不同时间、不同浓度的暴露后收集细胞备用。(三)转染将huh7细胞或hepg2细胞接种到培养板上,当融合度为80%时,进行转染,用dmem或1640培养液将过表达目的基因或mirna和抑制目的基因或mirna的inhibitor或干扰小rna稀释后混匀,37℃孵育15-20分钟。根据使用的培养板,先在每孔中加入不含双抗的培养液,再加入混合液,37℃孵育,6-8h后换新鲜培养液,培养后48h后用做实验。三、基因和microrna表达谱芯片检测采用affymetrixgenechipmousegene1.0sty和mirna3.0array,分别检测铁过负荷2周组和对照2周组c57小鼠肝脏基因和micrornas,表达,然后采用随机方差模型(rvm)来进行差异基因和microrna筛选,分析工具为multiclassdif。四、血清铁相关生化指标测定生化自动分析仪测定alt、ast,血清铁,tibc,ts的水平。五、小鼠肝脏普鲁士蓝染色方法肝脏样本在4%多聚甲醛溶液中进行固定,然后包埋,切片,最后用普鲁士蓝染色,显微镜镜下观察,并采集图像。六、小鼠肝脏he染色及炎症病理评分方法肝脏样本4%多聚甲醛固定,包埋,切片后,用苏木精和伊红染色,显微镜镜下观察,并采集图像,采用knodell法进行肝脏炎症病理评分。七、实时定量荧光pcr提取肝脏或细胞总rna测定浓度后,反转成cdna,将cdna与引物,sybrgreen除酶水一起配好反应体系后实时定量pcr进行扩增,根据ct值进行分析。八、western-blot提取肝脏组织或细胞总蛋白并测定浓度后,变性,凝胶电泳,转膜,封闭,一抗,二抗孵育后,显影。九、染色质免疫共沉淀法(chip)huh7接种到培养皿中,一组加pbs作为对照,另一直加holo-tf,孵育24h后,分别进行细胞的甲醛交联与超声破碎,蛋白/dna沉淀,洗脱,dna纯化,pcr扩增目的基因,检测扩增产物。十、数据的统计与分析实验数据用(±sem)表示。使用quantityone图像分析系统分析westernblotx条带;应用graphpadprism6.0软件进行实验数据分析,采用两独立样本t检验和单因素方差分析(one-wayanvoa)分析各组之间的差异,各组间两两比较采用tukeypost-hoc检验。结果以p<0.05为显著性水平。结果一、不同铁负荷小鼠肝脏基因和mirnas芯片检测(一)不同铁负荷小鼠肝脏基因表达谱检测通过基因芯片检测发现,不同铁负荷2周小鼠肝脏有3282个基因表达出现差异,其中中包括nf-κb信号通路关键分子tlr4、traf6、nf-κbia显著升高,铁稳态调控分子铁调素(hamp),铁蛋白轻链(ftl1)显著升高,而转铁蛋白受体(trfc)显著降低。(二)不同铁负荷小鼠肝脏micrornas变化铁负荷2周后,缺铁组,对照组和铁过负荷组小鼠肝脏中有差异的microrna有68种,其中包括traf6的调控因子mir-146α,说明mir-146α可能跟肝脏炎症有关。(三)pcr验证芯片结果实验结果表明,与对照组相比,mir-146α表达明显降低,铁稳态调控分子出现明显变化,进一步证实小鼠肝脏处于铁过负荷状态,nf-κb信号通路关键分子tlr4,traf6表达升高,上述结果与芯片检测结果一致。二、铁过负荷对肝脏mir-146α/traf6/nf-κb信号通路的影响(一)不同铁制剂对肝脏炎症反应的影响为了进一步确定急性io(而不是铁剂的其它结合成分)可引起肝组织炎症反应,建立正确的铁过负荷小鼠模型,我们比较了右旋糖苷(铁载体)、右旋糖酐铁、蔗糖铁,对小鼠肝铁蓄积和炎症的影响,结果表明,与对照组和右旋糖酐组相比,注射右旋糖酐铁和蔗糖铁组小鼠均能提高血清铁和转铁蛋白饱和度,和肝脏铁,血清铁蛋白水平,同时肝脏出现明显铁蓄积和炎症反应,我们选取右旋糖酐铁作为铁过负荷制剂,建立小鼠铁过负荷模型。(二)铁过负荷不同时间段小鼠肝脏铁稳态调控分子,mir-146α/traf6/nf-κb信号通路和下游炎症因子的表达变化为了进一步观察整体水平肝组织mir-146α表达变化在io引起炎症过程中的作用,我们比较了1,2,4周铁过负荷小鼠稳态调控基因,mir-146α/traf6/nf-κb信号通路和下游炎症因子的表达变化,实验结果表明1-4周铁过负荷小鼠肝脏铁稳态调控分子基因出现相应变化,同时可见mir-146α下降,nf-κb信号通路关键分子基因和蛋白表达升高,与芯片结果一致。三、铁过负荷影响mir-146α/traf6/nf-κb信号通路的分子机制(一)铁过负荷mir-146α表达降低对肝细胞traf6/nf-κb信号通路活性的影响1、不同浓度holo-tf对huh7细胞mir-146α表达影响为了确定细胞实验holo-tf的剂量,我们将huh7细胞分别暴露于0,15,30,60μm浓度下,实验结果表明,30μmholo-tf就可以诱导huh7细胞mir-146α降低。2、铁过负荷对不同人肝细胞株mir-146α表达影响为了确定铁过负荷引起的mir-146α变化是否存在细胞特异性,我们将在huh7,hepg2,l02,lx-2细胞在含30μmholo-tf细胞培养液中暴露24h,实验结果表明铁过负荷可引起上述细胞株铁稳态调节因子表达发生相应变化,同时伴有mir-146α明显下降。3、铁过负荷引起mir-146α降低对traf6/nf-κb信号通路活性的影响huh7和hepg2细胞在添加30μmholo-tf培养液暴露24h,结果显示上述细胞mir-146α表达降低,nf-κb信号通路关键分子tlr4,traf6,myd88,p65、炎症因子tnfα,il6蛋白和mrna表达升高。为了了解铁过负荷状态下,mir-146α与traf6/nf-κb信号通路关键分子表达的时间顺序,我们将huh7细胞在添加30μmholo-tf培养液分别暴露0,2,4,8,12,24,36,48h,实验结果表明pri-mir-146α和mir-146α表达在2h开始降低,并随着时间延长进一步降低;而tlr4,traf6,p65表达在12h开始升高,tnfα和il-6的表达在24h开始升高,随着时间延长进一步升高。4.过表达mir-146α对铁过负荷下huh7细胞nf-κb信号通路关键分子的影响为了明确铁过负荷mir-146α表达变化与nf-κb信号通路活性变化的关系,我们通过转染过表达mir-146α,实验结果表明,过表达mir-146α,可以抑制铁过负荷huh7细胞nf-κb信号通路关键分子traf6,可以部分抑制下游炎症因子表达升高幅度。而同时过表达mir-146α,122可以明显缓解铁过负荷引起的tnfa升高。(二)铁过负荷引起肝细胞mir-146α表达下降的分子机制1、铁过负荷下引起mir-146α表达变化的转录因子筛选将huh7和hepg2细胞在添加30μmholo-tf培养液暴露24h,结果显示,铁过负荷对转录因子stat3,pu.1,cebpβ表达无影响,hnf4α表达明显降低,将huh7细胞在在添加30μmholo-tf培养液分别暴露0~48h,结果hnf4α在2h明显下降,随着铁过负荷时间的延长,hnf4α表达逐步降低。2、转录因子hnf4α对mir-146α表达的调控作用首先通过质粒转染,发现过表达hnf4α,huh7细胞mir-146α表达升高;抑制hnf4α,mir-146α表达降低;然后将过表达hnf4α的huh7细胞在添加30μmholo-tf培养液暴露24h,与空载质粒组相比,mir-146α表达明显下降。染色质免疫共沉淀实验结果表明,铁过负荷时huh7细胞hnf4α与mir-146α结合活性明显减弱。3.hif1α和mir-34α变化对铁过负荷下肝细胞hnf4α表达变化的影响为了进一步阐明铁过负荷引起hnf4α/mir-146α表达降低的机制,我们检测了铁过负荷状态下对hnf4α调控因子表达的影响,实验结果表明与对照组相比,铁过负荷状态下c-fos,c-jun,TCF4等转录因子表达无明显变化,但铁过负荷可以引起对HNF4α有负性调控作用的miR-34α表达明显增加。在此基础上,我们通过转染miR-34αinhibitor,发现抑制了miR-34α表达,HNF4α表达明显升高。已知,具有铁感受作用的HIF1α对miR-34α存在转录调控作用。因此,我们通过质粒转染,发现过表达HIF1α,huh7细胞miR-34α表达升高,HNF4α和miR-146α明显降低;抑制HIF1α,miR-34α表达明显降低,HNF4α和miR-146α表达明显升高;在此基础上抑制HIF1α的Huh7细胞在添加30μM Holo-tf培养液暴露24h,与空载质粒组相比,HNF4α表达明显升高。结论一、miR-146α表达降低,TRAF6/NF-κB(p65)依赖性炎症因子的表达升高,是铁过负荷引起肝脏组织细胞出现炎症反应的重要途径之一;二、HIF1α及miR-34α表达升高引起的HNF4α表达降低可能是铁过负荷导致miR-146α表达下降的主要原因;三、过表达miR-146α可以缓解铁过负荷引起的肝脏炎症反应,其可能是防治铁过负荷引起肝脏损伤的潜在靶点。附图