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鼠单抗13D4(13D4mAb)是本实验筛选获得的一株针对高致病性禽流感(H5N1)的广谱中和单抗,在前期研究工作中,我们已经成功地对其进行了嵌合抗体(13D4cAb)的改造。血凝抑制试验(HI)和细胞中和实验已证实13D4cAb保留了亲本鼠单抗的广谱HI活性和中和活性,动物治疗试验也表明了13D4cAb对H5N1禽流感病毒具有广谱治疗效果。但嵌合抗体可变区中的鼠源序列仍然可以诱导人体产生HAMA,因此需要对其进一步人源化改造。本研究在13D4cAb的基础上,利用噬菌体展示技术进一步对其进行CDR移植改造。首先,选择同源性最高的人胚系基因1-69-04和1-39-01作为人源化模板;然后综合各种方法对13D4mAb可变区序列进行分析并确定骨架区上对抗体—抗原结合有影响的关键氨基酸残基,其中重链有12个,轻链有8个;利用简并引物对这些关键点进行回复突变,将人、鼠源译本同时编入人源化单链抗体库序列中;通过重叠延伸PCR技术合成人源化单链抗体基因片段库;利用噬菌体展示技术构建人源化单链抗体库,实际库容量达到3×10~7;通过血凝素蛋白(HA1)和YU22病毒板对抗体库进行筛选,利用ELISA方法检测获得37个阳性克隆;选取16个阳性序列克隆入双启动真核表达载体Plan3,利用293FT细胞进行瞬时转染,通过血凝抑制实验(HI)检测各人源化抗体的活性及广谱性,初步确定5个具有较好HI活性和广谱性的人源化抗体,编号分别为H1126-08,H1213-21,H1202-34,H1121-37,Y1121-29;利用FLP-in系统筛选这5个人源化抗体的稳定表达细胞株并进行人源化抗体的表达和纯化;通过定量ELISA实验初步比较了这5个人源化抗体与HA1抗原的结合活性,其中H1213-21及H1202-34的活性最好,其人源化程度分别为88.9%和89.4%。总之,通过噬菌体展示技术本研究成功地对13D4cAb进行了CDR移植,获得了多个人源化抗体,他们基本上保持了13D4cAb的广谱HI活性及与HA1抗原的结合活性。这些人源化抗体将大大降低13D4用于治疗人感染H5N1时的HAMA反应,为禽流感治疗性抗体的临床应用奠定基础。同时,本文也证明了利用噬菌体展示技术进行CDR移植是一个高效,简便的方法。